Original paper
The activity of selected lysosomal proteases of polymorphonuclear leukocytes in patients with actinic keratosis treated by photodynamic therapy (ALA-PDT)

Wprowadzenie

Rogowacenie słoneczne (łac. keratosis actinica) należy do najczęściej spotykanych stanów przednowotworowych skóry i dotyczyć może ok. 50% populacji powyżej 40. roku życia. Ryzyko transformacji nowotworowej szacuje się na 6–25% w przypadku raka kolczystokomórkowego. Istotą keratosis actinica jest rozrost naskórka i zmiany w tkance łącznej podścieliska. Powstawanie tej choroby wiąże się z działaniem szkodliwych czynników fizycznych (głównie promieniowania UV), chemicznych, mechanicznych na skórę osób, u których występują określone uwarunkowania genetyczne związane z upośledzeniem procesów naprawczych DNA [1].
Stany przednowotworowe skóry łączą się z procesem starzenia, który – jak się obecnie uważa – jest wypadkową dwóch podstawowych czynników, tj. podłoża genetycznego (tzw. starzenie wewnątrzpochodne) oraz wpływu czynników środowiskowych, a zwłaszcza promieni UV (starzenie zewnątrzpochodne, photoaging). Istnieją dwie teorie, tłumaczące mechanizmy zachodzące w komórkach, tkankach i narządach starzejącego się organizmu – teoria zaprogramowania, związana z tzw. gerontogenami, oraz teoria stochastyczna, zakładająca, że procesy starzenia łączą się z zaburzeniami biochemicznymi, wśród których wymienia się:
• nadmierną produkcję wolnych rodników tlenowych,
• racemizację aminokwasów prowadzącą do zaburzeń czynności białek,
• nieenzymatyczną glikozylację prowadzącą do nieprawidłowego usieciowania włókien kolagenu i innych białek strukturalnych.

W wyniku tych procesów może dochodzić do wystąpienia różnorodnych zmian w organizmie człowieka, m.in. w fizjologii skóry [2].
W wyniku działania promieni UV na skórę w przebiegu przewlekłych zapalnych procesów związanych z fotostarzeniem dochodzi do miejscowej i ogólnoustrojowej aktywacji wielojądrzastych granulocytów obojętnochłonnych (PMNL), odgrywających podstawową rolę w procesach obronnych organizmu. Wskutek pobudzenia PMNL uruchamia się kaskada reakcji biochemicznych, prowadzących do ich adherencji do powierzchni śródbłonka naczyń włosowatych, przemieszczania się przez ścianę naczyń z krwi do tkanek, rozpoznawania i pochłaniania cząstek opsonizowanych. Podczas tego procesu, związanego z wybuchem tlenowym, dochodzi do uwalniania produktów metabolizmu tlenowego komórki, produktów przemian biochemicznych, a także enzymów zawartych w wewnątrzkomórkowych ziarnistościach [3].
Obecnie jedną z podstawowych metod leczenia rogowacenia słonecznego jest terapia fotodynamiczna, która – jak się powszechnie uważa – w sposób bezinwazyjny prowadzi do wyleczenia nawet rozległych ognisk keratosis actinica.
Wykorzystywane w terapii fotodynamicznej promieniowanie UV należy do zakresu światła widzialnego (400–700 nm). Wykazuje ono różny stopień penetracji w głąb tkanek, w zależności od długości fali. Światło czerwone (>600 nm) penetruje najgłębiej, natomiast niebieskie i zielone do głębokości 2 mm.
Istotnym osiągnięciem w terapii fotodynamicznej było wprowadzenie w latach 90. ubiegłego wieku kwasu
5-γ-aminolewulinowego [4]. Kwas ten, wykorzystując drogę biosyntezy hemu, staje się po wniknięciu do komórki naturalnym prekursorem fotoaktywnej protoporfiryny IX (PpIX) [5]. Kwas 5-γ-aminolewulinowy jest substancją bezpieczną, a spektrum jego absorpcji dotyczy fal o długości 380–670 nm [6]. Miejscowa nadwrażliwość skóry po jego zastosowaniu utrzymuje się zwykle do
24 godz. [7].
Terapia fotodynamiczna (PDT) jest odmianą fotochemioterapii, w której wykorzystuje się środki światłouczulające, np. kwas 5-γ-aminolewulinowy oraz światło widzialne do wywołania selektywnego uszkodzenia i martwicy chorobowo zmienionych komórek [8].
Mechanizm działania PDT nie został jeszcze do końca poznany. Wiadomo, że wiąże się z toksycznym uszkodzeniem zmienionych chorobowo komórek, a miejscem działania PDT na poziomie komórkowym są różnorodne
organelle. Najistotniejsze jednak reakcje łączą się z przekazywaniem energii ze wzbudzonego środka światłouczulającego na atom tlenu cząsteczkowego, z wytworzeniem bardziej reaktywnego chemicznie tlenu singletowego. Istotę działania stanowi reakcja oksydacji błon lipidowych substratu (np. komórki nowotworowej) przez tlen singletowy, doprowadzająca do jej śmierci [9]. Reakcjom tym towarzyszy zjawisko apoptozy i niszczenie utkania naczyniowego guza [10], a zmniejszona rozpuszczalność fotosensibilizatorów i ich zatrzymywanie w obrębie zmiany nowotworowej wiąże się z obniżonym pH komórek guza [11].
Terapię fotodynamiczną wykorzystuje się w leczeniu m.in. stanów przednowotworowych, głównie keratosis
actinica [12], leukoplakii [13], choroby Bowena [14], nieczerniakowych nowotworów skóry [15–17], okresu wstępnego ziarniniaka grzybiastego [18], trądziku pospolitego [19], hirsutyzmu [20], cheilitis actinica [21], znamienia łojowego [22], łuszczycy [23], nowotworów pęcherza moczowego i dróg moczowych, oskrzeli, przełyku, pochwy, sromu i wielu innych [24].

Cel pracy

Celem pracy było określenie wpływu terapii fotodynamicznej (ALA-PDT) na aktywność wybranych proteaz
lizosomalnych (katepsyny G i katepsyn tiolowych) wielojądrzastych granulocytów obojętnochłonnych u chorych z rogowaceniem słonecznym.

Materiał i metody

Badania przeprowadzono u 61 osób podzielonych na
2 grupy:
a) grupę odniesienia (0) stanowiło 35 osób klinicznie zdrowych, w wieku 54–85 lat (68,18±9,35 roku); w grupie tej było 19 mężczyzn w wieku 54–79 lat (70,32±8,18 roku) oraz 16 kobiet w wieku 60–80 lat (68,44±10,34 roku) (tab. 1.); w grupie odniesienia nie wykazano żadnych odchyleń od stanu prawidłowego (w przeprowadzonych wywiadach, badaniu fizykalnym i podstawowych badaniach laboratoryjnych); osoby te poddały się badaniom dobrowolnie, świadome ich celu;
b) grupę badaną stanowiło 26 osób chorych z rogowaceniem słonecznym, 17 kobiet w wieku 61–89 lat (72,57±12,03 roku) i 9 mężczyzn w wieku 67–81 lat (74,00±6,51 roku) (tab. 1.); czas trwania choroby u kobiet wynosił 1–12 lat (4,31±2,91 roku), u mężczyzn 1–10 lat (3,5±3,39 roku) (tab. 2.).

Rozpoznanie kliniczne we wszystkich przypadkach potwierdzono badaniem histopatologicznym.

Terapia fotodynamiczna

Grupę badaną poddano terapii fotodynamicznej, w której zastosowano 15-procentowy roztwór kwasu
5-γ-aminolewulinowego (ALA), przygotowany przez Instytut Optoelektroniki WAT w Warszawie. Przed naświetlaniem na ogniska chorobowe stosowano aplikację ALA pod opatrunkiem okluzyjnym na 12 godz. Otoczenie zmian osłaniane było pastą cynkową. Do naświetlania ognisk chorobowych używano lampy halogenowej Philips 6820P z filtrem pomarańczowym o długości fali 590–760 nm (średnio 720 nm). Czas naświetlań wynosił 15–30 min, liczba naświetlań 1–3, a dawka promieniowania przypadająca na jedno naświetlanie 125–182 J/cm².
Chorzy poddani terapii fotodynamicznej (ALA-PDT) zgłaszali się co 10–14 dni na wizyty kontrolne, podczas których określano wskazania do kolejnych naświetlań. U większości pacjentów podczas naświetlania i do 2 dni po naświetlaniu w obrębie ogniska chorobowego i w promieniu do 2 cm występował rumień, obrzęk, pieczenie, a w niektórych przypadkach sączenie treścią surowiczą. Stopniowo ogniska rogowacenia słonecznego ulegały spłaszczeniu, pozostawiając różnie nasilone, ustępujące przebarwienia. U wszystkich chorych poddanych naświetlaniom (ALA-PDT) uzyskano całkowitą remisję (24-miesięczna obserwacja po leczeniu).

Izolowanie PMNL i oznaczanie enzymów lizosomalnych

Krew do badań pobierano na czczo, w warunkach jałowych, z żyły zgięcia łokciowego w ilości 20 ml. Neutrofile
izolowano wg metody Farrantego i Thonga w modyfikacji Zemana i wsp. [25]. Do izolacji użyto Gradisolu G.
Następnie metodą kolorymetryczną, używając estru aminokwasowego-2-naftolu jako substratu, oznaczano aktywność katepsyny G [26] i katepsyn tiolowych [26] (w µmol/mg białka/godz.) w lizosomach i nadsączu lizosomalnym wielojądrzastych granulocytów obojętnochłonnych krwi obwodowej osób zdrowych i chorych
z keratosis actinica.
Badania w grupie odniesienia (osób zdrowych) przeprowadzono jednorazowo, natomiast w grupie badanej (osób chorych) 2-krotnie, tj. przed rozpoczęciem leczenia i po 2. cyklu leczenia metodą ALA-PDT.
Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej,
wykorzystując test t-Studenta do prób niezależnych (t) oraz zależnych (T).

Wyniki badań

W badaniach aktywność katepsyny G (enzym wolny) w nadsączu lizosomalnym wielojądrzastych granulocytów obojętnochłonnych krwi obwodowej w grupie badanej
(keratosis actinica) przed leczeniem w porównaniu z grupą odniesienia, u kobiet i mężczyzn oddzielnie, a także w całej grupie osobowej była statystycznie wyższa (odpowiednio p<0,001; p<0,01) (tab. 3. i 3b., ryc. 1.).
Aktywność katepsyny G (enzym wolny) w nadsączu lizosomalnym wielojądrzastych granulocytów obojętnochłonnych krwi obwodowej w grupie badanej (keratosis actinica) po leczeniu, w porównaniu z grupą odniesienia u kobiet i mężczyzn oddzielnie, a także w całej grupie była statystycznie znamienna wyższa (p<0,01) (tab. 3. i 3b., ryc. 1.).
Aktywność katepsyny G (enzym wolny) w nadsączu lizosomalnym wielojądrzastych granulocytów obojętnochłonnych krwi obwodowej w grupie badanej (keratosis actinica) przed leczeniem w porównaniu z jej aktywnością po leczeniu była wyższa, jednak różnica ta nie była znamienna statystycznie (p>0,05) (tab. 3. i 3b., ryc. 1.).
Aktywność katepsyny G (enzym związany) w lizosomach wielojądrzastych granulocytów obojętnochłonnych krwi
obwodowej w grupie badanej (keratosis actinica) przed leczeniem w porównaniu z grupą odniesienia u kobiet była znamiennie statystycznie wyższa (p<0,01), także u mężczyzn i w całej grupie badanej (p<0,001) (tab. 3a. i 3b., ryc. 1a.).
Aktywność katepsyny G (enzym związany) w lizosomach wielojądrzastych granulocytów obojętnochłonnych krwi
obwodowej w grupie badanej (keratosis actinica) po leczeniu, w porównaniu z grupą odniesienia u kobiet i mężczyzn oddzielnie, a także w całej grupie była znamiennie statystycznie wyższa (p<0,05) (tab. 3a. i 3b., ryc. 1a.).
Aktywność katepsyny G (enzym związany) w lizosomach wielojądrzastych granulocytów krwi obwodowej w grupie badanej (keratosis actinica) przed leczeniem w porównaniu z aktywnością po leczeniu była znamiennie statystycznie wyższa (p<0,05) (tab. 3a. i 3b., ryc. 1a.).
Aktywność katepsyn tiolowych (enzymy wolne i związane) w nadsączu lizosomalnym i lizosomach wielojądrzastych granulocytów obojętnochłonnych krwi obwodowej w grupie badanej (keratosis actinica) zarówno przed leczeniem, jak i po, w porównaniu z grupą odniesienia u kobiet i mężczyzn oddzielnie, a także w całej grupie osobowej
była wyższa, jednakże różnicy znamiennej statystycznie nie wykazano (p>0,05) (tab. 4., 4a., 4b., ryc. 2., 2a.).
Aktywność katepsyn tiolowych (enzym wolny i związany) w grupie badanej (keratosis actinica) przed leczeniem, w porównaniu z aktywnością po leczeniu była również wyższa, jednakże różnic znamiennych statystycznie nie wykazano (p>0,05) (tab. 4., 4a., 4b., ryc. 2., 2a.).

Omówienie wyników

W dostępnym piśmiennictwie nie znaleziono badań dotyczących aktywności enzymów lizosomalnych wielojądrzastych granulocytów obojętnochłonnych u chorych ze stanami przednowotworowymi skóry, leczonych metodą fotodynamiczną. Również doniesienia nt. aktywności enzymatycznej PMNL w przebiegu różnych chorób skóry i ich leczenia tą metodą należą do nielicznych.
W badaniach prowadzonych przez Ruszczaka i wsp., u osób z uogólnionymi postaciami łuszczycy pospolitej wykazano zmniejszoną aktywność katepsyny G i normalizację jej poziomu po leczeniu za pomocą naświetlań metodą PUVA (psoraleny i promieniowanie UVA) [27].
Oceniano również aktywność katepsyny G w atopowym zapaleniu skóry zarówno przed, jak i po naświetlaniach UVA. W badaniach wykazano, że zmniejszenie aktywności tej proteazy występuje po naświetlaniu średnimi dawkami UVA i towarzyszy poprawie stanu miejscowego [28].
Wykazanie w badaniach własnych znamiennie wyższej aktywności katepsyny G w PMNL krwi obwodowej u chorych z keratosis actinica w porównaniu z nieznacznie podwyższoną aktywnością katepsyn tiolowych może świadczyć o udziale tego enzymu w procesach fotostarzenia skóry i rozwoju nowotworów.
Jednocześnie zaobserwowano korzystny wpływ naświetlań metodą ALA-PDT ognisk rogowacenia słonecznego na normalizację aktywności katepsyny G (spadek aktywności) i katepsyn tiolowych, mimo że aktywność tych enzymów pozostawała po leczeniu nadal na stosunkowo wysokim poziomie.
Opisywano niską aktywność katepsyny G w płynie wysiękowym w przewlekle utrzymujących się owrzodzeniach i wysoki jej poziom w płynie pochodzącym ze świeżo powstałych ran [29].
Herrmann i wsp. wykazali wprost proporcjonalną zależność między aktywnością katepsyny G a poziomem fibrynogenu u chorych z zawałem mięśnia sercowego czy udarem mózgu [30].
Woźniak i wsp. oceniali aktywność arylosulfatazy,
katepsyny D i fosfatazy kwaśnej w potwierdzonych histopatologicznie rakach płaskonabłonkowych płuc. Autorzy ci uznali, iż wyniki badań dowodzą, że zwiększona aktywność enzymów lizosomalnych może być przydatna w diagnostyce i monitorowaniu tych nowotworów [31].
Tappel przedstawił hipotezę, że wydzielane w przewodach mlecznych gruczołu piersiowego na drodze egzocytozy enzymy lizosomalne wpływają na rozwój raka piersi. Na uaktywnienie enzymów lizosomalnych oddziałują czynniki ryzyka rozwoju raka sutka, takie jak estrogeny, promieniowanie ultrafioletowe, skażenie środowiska czy dieta.
Ocena aktywności enzymów lizosomalnych w nowotworach piersi może być wykorzystywana do badań przesiewowych [32]. Ten sam autor zaobserwował udział enzymów lizosomalnych w inicjowaniu raka gruczołu krokowego i możliwości wykorzystania tych enzymów w podobnych badaniach [33].
Liaudet-Coopman i wsp. wskazują na udział katepsyny D w procesie angiogenezy, stymulacji proliferacji komórek nowotworowych i hamowaniu ich apoptozy. Katepsyna D pełni funkcję mediatora w indukowanej apoptozie, a jej aktywność proteolityczna wyzwalana jest w tym mechanizmie. W nowotworach piersi jest markerem źle prognozującym, ściśle związanym z rozprzestrzenianiem się przerzutów [34].
Badania własne wskazują na udział katepsyn, a w szczególności katepsyny G, w procesach prowadzących do
rozwoju stanów przednowotworowych i nowotworów skóry i możliwość wykorzystania oznaczeń ww. enzymów do monitorowania rozwoju tych procesów i korzystnych
wyników leczenia.
Levicar i wsp. opisują zwiększone wydzielanie katepsyn B, D i L w guzach ośrodkowego układu nerwowego, dotychczas najlepiej zbadane w oponiakach i gwiaździakach [35].
Altorjay i wsp. zwracają uwagę na wzrost aktywności katepsyny B, α-mannozydazy i dipeptydylopeptydazy u chorych z gruczolakorakami połączenia przełykowo-żołądkowego w porównaniu z aktywnością tych enzymów u osób zdrowych. Autorzy wykazują statystyczną korelację między aktywnością ww. enzymów a stopniem zróżnicowania nowotworu i stopniem zajęcia węzłów chłonnych. Opisują niższą ich aktywność w guzach wyżej zróżnicowanych, bez przerzutów i u tych chorych, którzy przeżyli 2 i więcej lat po interwencji chirurgicznej [36].
Wyniki badań własnych potwierdzają rolę wielojądrzastych granulocytów obojętnochłonnych w patogenezie najczęstszego stanu przednowotworowego skóry, jakim jest rogowacenie słoneczne. Ocena aktywności enzymatycznej PMNL w przebiegu leczenia metodą fotodynamiczną z wykorzystaniem kwasu aminolewulinowego może służyć monitorowaniu terapii i kontroli możliwego nawrotu (wznowy) procesu chorobowego.

Praca finansowana przez Uniwersytet Medyczny w Łodzi w ramach działalności statutowej Nr 503-5064-1.

Piśmiennictwo

1. Polak-Pacholczyk I, Kaszuba A. Terapia fotodynamiczna stanów przednowotworowych i nieczerniakowych nowotworów skóry. W: Choroby i nowotwory skóry wywołane promieniowaniem ultrafioletowym. Kaszuba A, Zieliński KW (red.). Wyd. Adi, Łódź 2004; 91-101.
2. Majewski S. Starzenie się skóry. Choroby i nowotwory skóry wywołane promieniowaniem ultrafioletowym. W: Choroby i nowotwory skóry wywołane promieniowaniem ultrafioletowym. Kaszuba A, Zieliński KW (red.), Wyd. Adi, Łódź 2004; 21-8.
3. Zeman K. Współczesne poglądy na rolę granulocytów obojętnochłonnych (neutrofilów) w procesach zapalnych. Immunol Pol 1993; 18: 3-21.
4. Osiecka BJ, Ziółkowski P, Woźniak Z i wsp. Miejscowe zastosowanie kwasu aminolewulinowego w leczeniu nowotworów
złośliwych skóry. Acta Bio-Opt Inform Med 2001; 7: 73-7.
5. Collins P, Robinson DJ, Stringer MR, et al. The variable response of plaque psoriasis after a single treatment with topical 5-aminolaevulinic acid photodynamic therapy.
Br J Dermatol 1997; 137: 743-9.
6. Jeffes EW, McCullough JL, Weinstein GD, et al. Photodynamic therapy of actinic keratosis with topical 5-aminolevulinic acid. Arch Dermatol 1997; 133: 727-32.
7. Fink-Puches R, Wolf P, Kerl H. Photodynamic therapy of superficial basal cell carcinoma by instillation of aminolevulinic acid and irradiation with visible light. Arch Dermatol 1997; 133: 1494-5.
8. Stables GI. Photodynamic therapy in dermatology. J Dermatol Treat 1999; 10: 213-9.
9. Ziółkowski P, Milach J. Porfiryny jako fotouczulacze – ich zastosowanie w leczeniu i rozpoznawaniu nowotworów. Mag Med 1992; 2-3: 11-3.
10. Agarwal R, Korman NJ, Mohan RR, et al. Apoptosis is an early event during phthalocyanine photodynamic therapy induced ablation of chemically induced squamous papillomas in mouse skin. Photochem Photobiol 1996; 63: 547-52.
11. Spicer MS, Goldberg DJ. Lasery w dermatologii. Program samokształcenia. J Am Acad Dermatol 1997; test 10: 110-25.
12. Kurwa HA, Yong-Gee SA, Markey AC, et al. A comparison of photodynamic therapy with topical 5-fluorouracil in the treatment of actinic keratoses. Br J Dermatol 1998; 139: 74.
13. Kawczyk-Krupka A, Wiczkowski A, Adamek M, Sieroń A. Terapia fotodynamiczna i jej znaczenie immunomodulujące w leczeniu chorób skóry i leukoplakii jamy ustnej. Acta Bio-Opt Inform Med 2001; 7: 67-72.
14. Cochito M, Campos Lopes JM, Leite L. Topical photodynamic therapy in a case of Bowen’s disease of the face. Skin Cancer 1996; 11: 215-8.
15. Ibbotson SH. Topical 5-aminolaevulinic acid photodynamic therapy for the treatment of skin conditions other than non-melanoma skin cancer. Br J Dermatol 2002; 146: 178-88.
16. Hürlimann AF, Hänggi G, Panizzon RG. Photodynamic therapy of superficial basal cell carcinomas using topical 5-aminolevulinic acid in a nanocolloid lotion. Dermatology 1998; 197: 248-54.
17. Stables GI, Stringer MR, Robinson DJ, Ash DV. Large patches of Bowen’s disease treated by topical aminolaevulinic acid photodynamic therapy. Br J Dermatol 1997; 136: 957-60.
18. Wolf P, Fink-Puches R, Cerroni L, Kerl H. Photodynamic therapy for mycosis fungoides after topical photosensitization with
5-aminolevulinic acid. J Am Acad Dermatol 1994; 31: 678-80.
19. Meffert H, Gaunitz K, Gutewort T, Amlong UJ. Therapy of acne with visible light decreased irradiation time by using a blue-light high energy lamp. Dermatol Monatsschr 1990; 176; 597-603.
20. Grossman M, Wimberly J, Dwyer P. PDT for hirsutism. Lasers Surg Med 1995; S7: 44.
21. Stender IM, Wulf HC. Photodynamic therapy with 5-aminolevulinic acid in the treatment of actinic cheilitis. Br J Dermatol 1996; 135: 454-6.
22. Dierickx CC, Goldenhersh M, Dwyer P, et al. Photodynamic therapy for nevus sebaceus with topical delta-aminolevulinic acid. Arch Dermatol 1999; 135: 637-40.
23. Collins P, Robinson DJ, Stringer MR, et al. The variable response of plaque psoriasis after a single treatment with topical 5-aminolaevulinic acid photodynamic therapy.
Br J Dermatol 1997; 137: 743-9.
24. Robak T. Leczenie fotodynamiczne nowotworów. Pol Tyg Lek 1992; 47: 24-26, 558-61.
25. Zeman K, Tchórzewski H, Majewska E i wsp. Prosta i szybka metoda równoczesnej izolacji z krwi obwodowej wysoce oczyszczonych limfocytów i granulocytów obojętnochłonnych. Immunol Pol 1988; 23: 217-24.
26. Barret AI. Lysosomes a Laboratory Handbook. Dingle IT (ed.). North-Holand, Amsterdam 1972; 46-135.
27. Ruszczak Z, Czarnecki M, Bienias L. Photochemotherapie und activität lysosomaler enzyme in Blutserum bei psoriasiskranken. Dermatol Monatsschr 1984; 170: 573.
28. Brecukman F, von Kobyletzki G, Avermaete A, et al. Modulation of cathepsin G expression in severe atopic dermatitis following medium dose UVA 1 phototherapy. BMC Dermatol 2002; 2: 1-5.
29. Weckroth M, Vaheri A, Lauharanta J, et al. Matrix metalloproteinases, gelatinase and collagenase, in chronic leg ulcers. J Invest Dermatol 1996; 106: 1119-24.
30. Herrmann SM, Funke-Kaiser H, Schmidt-Petersen K, et al. Characterization of polymorphic structure of cathepsin G gene: role in cardiovascular and cerebrovascular diseases. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001; 21: 1538-43.
31. Woźniak A, Drewa T, Rozwodowska M, et al. Activity of some lysosomal enzymes in serum and in tumors of patients with squamous cell lung carcinoma. Neoplasma 2002; 49: 10-5.
32. Tappel A. Lysosomal enzymes and initiation of breast cancer. Med Hypotheses 2005; 64: 288-9.
33. Tappel A. Lysosomal and prostasomal hydrolytic enzymes and redox processes and initiation of prostate cancer. Med Hypotheses 2005; 64: 1170-2.
34. Liaudet-Coopman E, Beaujouin M, Derocq D, et al. Cathepsin D: newly discovered functions of a long-standing aspartic protease in cancer and apoptosis. Cancer Lett 2006; 237: 167-79.
35. Levicar N, Strojnik T, Kos J, et al. Lysosomal enzymes, cathepsin in brain tumour invasion. J Neurooncol 2002; 58: 21-32.
36. Altorjay A, Paal B, Sohar N, et al. Significance and prognostic value of lysosomal enzyme activities measured in surgically operated adenocarcinomas of the gastroesophageal junction ond squamous cell carcinomas of the lower third of esophagus. World J Gastroenterol 2005; 11: 5751-6.