Caspase-1 – a role in an evolution of systemic sclerosis

Adres do korespondencji: dr med. Bożena Dziankowska-Bartkowiak, Zakład Immunodermatologii, Katedra i Klinika Dermatologii, Uniwersytet Medyczny, 90-017 Łódź, ul. Krzemieniecka 5, tel. +48 42 686 79 81, 686 25 70, faks +48 42 688 45 65, e-mail: bozenadz@interia.pl



Wstęp
Twardzina układowa (systemic sclerosis – SSc) jest wielonarządową chorobą tkanki łącznej, w której patomechanizm włóknienia nie został do końca poznany. Postuluje się wpływ różnorodnych czynników, których wzajemne współdziałanie wydaje się być odpowiedzialne za rozwój procesu chorobowego.
W patogenezie twardziny podkreślana jest istotna rola, jaką odgrywają zaburzenia odczynowości komórkowej i humoralnej. W skórze i narządach wewnętrznych chorych z SSc wykrywana jest zwiększona liczba limfocytów T, komórek plazmatycznych, tucznych, makrofagów, eozynofili i bazofili, które poprzez efekt cytotoksyczny, jak również zwiększoną ekspresję niektórych cytokin modyfikują czynność fibroblastów i mogą być odpowiedzialne za uszkodzenie komórek śródbłonka [1]. Szczególna rola przypisywana jest aktywnym limfocytom T pomocniczym HLA DR-dodatnim [2]. W twardzinie gromadzą się one w nadmiernych ilościach głównie wokół zmienionych naczyń krwionośnych i są jednym z czynników stymulujących fibroblasty do wzmożonej produkcji kolagenu [3]. Kahari i Murrel sugerują, że w SSc ogniwem łączącym różnorodne czynniki patogenetyczne mogą być wolne rodniki generowane przez komórki uczestniczące w procesach zapalnych [4, 5]. Powstają one w wyniku zaburzeń w mikrokrążeniu, uszkodzenia śródbłonków naczyń krwionośnych i niedotlenienia [6]. Na skutek długotrwałego destrukcyjnego działania aktywnych form tlenu w komórkach dochodzi do obkurczenia mitochondriów i uszkodzenia ich grzebienia oraz zniszczenia błon innych organelli komórkowych i fragmentacji jądra, co w konsekwencji prowadzi do obumierania komórki w procesie apoptozy [7]. Połączenie białka powierzchniowego Fas/Apo-1 z ligandem Fas, powodujące zwiększenie ekspresji genu kodującego fosfatazę komórek hemopoetycznych (Hcph) oraz aktywację limfocytów i jest jednym z czynników inicjujących zaprogramowaną śmierć komórek [8] Degradacja DNA spowodowana przez proteolizę inhibitora endonukleazy (ICAD – inhibitor of caspase-activated Dnase) doprowadza do aktywacji DNA-zy (CAD – caspase-activated deoxyribonuclease), enzymu nasilającego rozpoczętą już destrukcję kwasu DNA [9]. Najnowsze badania wykazały, że zmiany DNA w różnych komórkach nie przebiegają w jednakowy sposób, a wewnątrzkomórkowe proteazy mogą odgrywać zasadniczą rolę w zapoczątkowywaniu apoptozy [10]. Podkreślany jest istotny wpływ specyficznych komórkowych proteaz cysteiny (cysteine-aspartic acid specific proteases), nazywanych kaspazami [11]. Wszystkie kaspazy syntetyzowane są w komórkach w formie proenzymatycznej, w postaci zymogenu [10].
Mechanizm apoptozy podlega regulacji zarówno genetycznej, jak i biochemicznej [12]. Obecnie wydaje się, że istnieją co najmniej 2 niezależne, nakładające się na siebie drogi aktywacji apoptozy – receptorowa (zewnątrzpochodna) z aktywacją kaskady kaspaz oraz mitochondrialna (wewnątrzkomórkowa), przebiegająca bez ich udziału [13]. Wiadomo, że enzymy proteolityczne niszczą białka strukturalne i komórki enzymatyczne, jednak ich rola nie została dokładnie poznana.
Kaspaza-1 została określona jako enzym konwertujący interleukinę 1β (interleukin-β converting enzyme – ICE), prointerleukinę 18 oraz fosfolipazę A2 [14, 15]. Wyniki badań wskazują, że ten enzym proteolityczny, aczkolwiek nie jest niezbędny w procesie apoptozy, to spełnia istotną rolę w uwalnianiu cytokin i rozwoju procesu zapalnego [14, 15].
Materiał i metody
Do badań zakwalifikowano 17 chorych z twardziną układową (9 z lSSc i 8 z dSSc), w tym 14 kobiet i 3 mężczyzn w wieku 16–66 lat, którzy spełniali kryteria ACR dla rozpoznania twardziny układowej [16].
Stężenie kaspazy-1 oznaczano 2-krotnie – podczas pierwszego badania i po 12 mies., stosując metodę immunoenzymatyczną (ELISA) z użyciem komercyjnego zestawu firmy Quantikine R&D Systems Inc Minneapolis (USA). Czułość badania oznaczano na 0,68 pg/ml. Grupę kontrolną stanowiło 10 osób klinicznie zdrowych (9 kobiet i 1 mężczyzna) w wieku 25–64 lat.
Badani chorzy i zdrowe osoby wyrazili zgodę na udział w badaniu, na które uzyskano zgodę Komisji Bioetyki przy UM w Łodzi.
Wszyscy pacjenci byli poddani badaniu klinicznemu. Rozległość i nasilenie stwardnień skóry oceniano, stosując skalę punktową Total Skin Score (TSS) wg Kahaleha i wsp. (punktacja od 0 do 3, maksymalna liczba punktów – 66) [17].
W celu oceny obecności zmian w poszczególnych narządach wewnętrznych przeprowadzono następujące specjalistyczne badania: scyntygrafia przełyku; EKG,
24-godzinne monitorowanie EKG metodą Holtera (rejestratory FD3, analiza 3 kanałów CS-2, CM-5, IS z użyciem systemu Oxford Medilog Excel –2); echokardiografia serca (z użyciem aparatu H-P 2500), badanie spirometryczne płuc (określano w procentach wartości należnej: natężonej pojemności życiowej – FVC, natężonej objętości wydechowej pierwszosekundowej – FEV1 i wskaźnika FEV1/FVC); zaburzenia wentylacji płuc o typie restrykcyjnym rozpoznawano przy zmniejszeniu FVC poniżej 80% wartości należnej i podwyższonej lub mieszczącej się w granicach normy wartości wskaźnika FEV1/FVC; zmiany o charakterze obturacyjnym – przy ograniczeniu wartości FEV1 i o typie mieszanym, gdy zmniejszenie wartości należnych FVC i FEV1 było podobne [18]; badanie pojemności dyfuzyjnej tlenku węgla w pojedynczym oddechu (DLCO) z zastosowaniem Master Laboratory Screen (Jaeger Toennies, Wuerzburg, Niemcy); wartości wyrażane były w procentach, porównywanych do należnych wartości; radiologiczne badanie klatki piersiowej, kości rąk i stóp.
U wszystkich pacjentów wykonano ponadto badania laboratoryjne, takie jak OB, badanie morfologiczne krwi, badanie ogólne moczu, oznaczenie stężenia mocznika i kreatyniny w surowicy. Określenie rodzaju przeciwciał przeciwjądrowych wykonano na substracie komórek nowotworowych raka krtani HEp-2 (zestaw standardowy firmy Sigma Diagnostics), stosując pośrednią metodę immunofluorescencji (IIF). Dokładną ich identyfikację przeprowadzono, wykorzystując metodę podwójnej immunodyfuzji w żelu agarowym (double immunodiffusion – DID) wg Ouchterlony’ego wobec ekstraktu grasicy cielęcej zawierającej rozpuszczalne antygeny jądrowe [19].
Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej z zastosowaniem testu rang Spearmana, Mann-Whitneya oraz Cochran-Coxa w celu porównania par wartości średnich i median. Wartości p<0,05 uznawano za statystycznie znamienne.
Wyniki
Charakterystykę kliniczną badanych przedstawiono w tab. 1.
Wykazano, że średnie wartości stężenia kaspazy-1 w surowicy były niższe u chorych z SSc (61,6±76,4 pg/ml) niż u osób klinicznie zdrowych (212,4±246,2 pg/ml). Stwierdzono także, że w badanej grupie chorych na twardzinę układową były one niższe w grupie chorych z odmianą lSSc (36,5±59,4 pg/ml) niż u pacjentów z dSSc (89,7±87,1 pg/ml). Różnice te były statystycznie znamienne (p<0,05) (ryc. 1.). Po 12 mies. badania wykazały wzrost stężeń kaspazy-1 w surowicy badanych pacjentów (SSc – 125,5±103,5 pg/ml; lSSc – 91,5±75,1 pg/ml; dSSc – 163,8±122,0 pg/ml) (ryc. 1.).
Nie stwierdzono, by stężenia kaspazy-1 korelowały z czasem trwania objawu Raynauda i czasem trwania stwardnień skóry (tab. 2.). Podczas pierwszego badania wykazano natomiast ujemną korelację stężeń kaspazy-1 ze stopniem nasilenia stwardnień skóry (r=-0,711; p<0,05) (ryc. 2.). Po 12 mies. obserwowano zmniejszenie nasilenia stwardnień skóry i postaci klinicznej diffuse SSc w całej badanej grupie (tab. 1.). Zależność pomiędzy ich nasileniem a stężeniem kaspazy-1 była także znamienna i miała charakter dodatni: w SSc (r=0,675; r=0,003), lSSc (r=0,845; p=0,004) natomiast w dSSc nie była statystycznie znamienna (r=0,407; p>0,05) (ryc. 3.).
Dalsza analiza w podgrupie lSSc wykazała korelację o ujemnym charakterze pomiędzy stężeniami kaspazy-1 i liczbą narządów, w których wykazano obecność swoistych zmian oraz odchyleń w badaniach dodatkowych (r=-0,709) (tab. 2.).
Dyskusja
W ostatnich latach zebrano wiele dowodów na to, że w patogenezie wielu chorób, w tym również kolagenoz, znaczącą rolę odgrywa zaburzony proces eliminacji pobudzonych komórek limfatycznych.
Apoptoza jest jednym z procesów, który odpowiada za stan tolerancji w stosunku do antygenów własnych organizmu. Dzięki niej eliminowane są z ustroju niedojrzałe limfocyty, które posiadają receptory dla epitopów własnych komórek oraz dla antygenów zgodności tkankowej – HLA [20]. Zahamowanie procesu genetycznie zaprogramowanej śmierci komórki doprowadza do nadmiernej aktywacji limfocytów T i B, co jest przyczyną produkcji autoprzeciwciał. Przypuszcza się, że osłabienie lub nasilenie apoptozy może być ważnym czynnikiem patogenetycznym w wielu chorobach [12]. Badania autorów wskazują na istotne znaczenie zaburzeń w regulacji tego procesu, także w rozwoju twardziny układowej [21]. Autorzy podają, że w tej chorobie zmiany zapalne ścian naczyń krwionośnych oraz proliferacja fibroblastów mogą być wynikiem zwiększonej produkcji czynników wzrostowych lub obniżonej wrażliwości tych komórek na czynniki indukujące apoptozę [21]. U chorych na twardzinę układową wykazano zwiększoną apoptozę w komórkach jednojądrowych krwi obwodowej [22] oraz zaburzenia ekspresji genu bcl-2 i ich nieprawidłową odpowiedź na kamptotecynę [23].
Wyniki badań eksperymentalnych wskazują, że odzwierciedleniem nasilenia apoptozy może być stężenie enzymów katabolicznych w surowicy oraz inicjująca rola, jaką kaspazy-1, -4, -5 oraz -11 spełniają w jej rozwoju [23]. Teraki i wsp. podkreślają znaczenie kaspazy-1 w apoptozie indukowanej przez Fas, która w kaskadzie proteaz cysteiny aktywuje proteazę efektorową – kaspazę-3 [10]. Kaspaza-1 jest także enzymem, który pełni istotną rolę w uwalnianiu cytokin i rozwoju zapalenia [24].
Prace niektórych autorów wskazują, że aktywacja kaspaz może być jednym z mechanizmów zapoczątkowujących apoptozę, a kaspaza-1 jest ważnym czynnikiem w rozwoju zapalenia alergicznego [25]. W badaniach przeprowadzonych u chorych z całorocznymi objawami astmy oskrzelowej i/lub alergicznego nieżytu nosa stwierdzono wyższe stężenia kaspazy-1 w surowicy niż u osób zdrowych [25]. Wykazano także korelację stężeń tego enzymu z nasileniem apoptozy komórek jednojądrowych izolowanych z krwi obwodowej tych chorych [26].
W dotychczasowym piśmiennictwie nie znaleziono danych na temat badań określających rolę kaspazy-1 w patogenezie twardziny układowej. W niniejszej pracy po raz pierwszy wykazano niższe stężenia kaspazy-1 w surowicy badanych chorych w porównaniu z grupą kontrolną, co potwierdza wpływ zaburzeń w sekrecji tej proteazy na prawidłowy przebieg apoptozy. Prawdopodobnie zmniejszone stężenie tego enzymu jest jednym z czynników hamujących apoptozę w początkowym okresie twardziny, co prowadzi do aktywacji limfocytów. Badania przeprowadzone u chorych z astmą oskrzelową i/lub alergicznym nieżytem nosa i nadwrażliwością na aspirynę wykazały, że zmniejszona apoptoza komórek nacieku zapalnego w polipach nosa jest odzwierciedleniem ważnej roli mechanizmu miejscowego zapalenia i może być związana z utrzymywaniem się i ciężkością choroby u tych pacjentów [27].
Zastanawiano się, czy stosowane leczenie może wpływać na stężenie kaspazy-1 w badanej grupie chorych na twardzinę układową. Badania prowadzone w grupie chorych, u których stosowano leki immunosupresyjne, jak i w grupie pacjentów otrzymujących jedynie leki rozszerzające naczynia i witaminę E, wykazały, że stężenia kaspazy-1 w surowicy były niższe niż w grupie kontrolnej. Kolejne oznaczenie stężenia wykonane po 12 mies. obserwacji, w trakcie kontynuacji terapii, ujawniło jego wzrost. Można zatem wysunąć przypuszczenie, że stosowane leki nie wpłynęły na zmianę mechanizmu genetycznie zaprogramowanej śmierci komórek, a ocena stężeń kaspazy-1 w surowicy chorych może być wykładnikiem aktywności procesu chorobowego. Potwierdzeniem tego przypuszczenia może być wykazanie w trakcie pierwszego badania istotnego związku nasilenia zmian skórnych z niższymi stężeniami kaspazy-1 u chorych z diffuse SSc, a u chorych z limited SSc z obecnością swoistych zmian w różnych narządach wewnętrznych i odchyleń w badaniach dodatkowych. Kolejnym dowodem na przydatność oznaczeń stężeń kaspazy-1 jako wykładnika nasilenia procesu chorobowego jest stwierdzenie w czasie drugiego badania znamiennej korelacji pomiędzy jej wyższymi stężeniami i stopniem nasilenia stwardnień skóry.
Uzyskane w trakcie przeprowadzonych badań wyniki mogą sugerować istotną rolę, jaką spełnia kaspaza-1 w przebiegu procesu eliminacji komórek odpowiedzialnych za przebieg fibrynogenezy w twardzinie układowej.

Praca finansowana z funduszy pracy własnej
nr 502-18-344 oraz statutowej nr 503-119-2 UM w Łodzi.
Piśmiennictwo
1. White B: Pathogenesis: Immune aspects. In: Clements PJ, Furst DE (eds): Systemic sclerosis. Williams & Wilkins. Baltimore, Maryland, USA, 1996: 229-50.
2. Haustein VF, Anderegg U: Pathophysiology of scleroderma: an update. J Eur Acad Dermatol Venereol 1998, 11; 1-8.
3. LeRoy EC: Increased collagen synthesis by scleroderma fibroblasts in vitro: a possibible defect in the regulation or activation of the scleroderma fibroblasts. J Clin Invest 1974; 54: 880-9.
4. Kahari VM: Activation of dermal connective tissue in scleroderma. Ann Med 1993; 25: 511-8.
5. Murrel D: A radical proposal for the pathogenesis of scleroderma. J Am Acad Dermatol 1993; 28: 78-85.
6. Granger DN: Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischaemia-reperfusion injury. Am J Physiol 1988; 255: 260-9.
7. Komosińska K, Olczyk K, Winsz K: Rola wolnych rodników w etiopatogenezie twardziny układowej. Post Hig Med Dośw 1997; 51: 285-303.
8. Shultz LD, Schweitzer PA, Rajan TV, et al.: Mutation at murine motheaten locus are within the hematopoietic cell protein-tyrosine phosphatase (Hcph) gene. Cell 1993; 73: 1445-8.
9. Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, et al.: A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis and its inhibitor ICAD. Nature 1998; 391: 43-50.
10. Teraki Y, Shiohara T: Apoptosis and the skin. Eur J Dermatol 1999; 9: 413-26.
11. Salvesen GS, Dixit VM: Caspases: Intracellular signaling by proteolysis. Cell 1997; 91 (14): 443-6.
12. Cohen JJ: Overview: mechanisms of apoptosis. Immunology Today 1993; 14 (3): 126-30.
13. Susin SA, Daugas E, Ravagnan L, et al.: Two distinct pathways leading to nuclear apoptosis. J Exp Med 2000; 92: 571-80.
14. Thornberry NA, Bull HG, Calaycay JR, et al.: A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1 beta processing in monocytes. Nature 1992; 356: 768-74.
15. Miwa K, Asano M, Horai R, et al.: Casapase 1 – independent IL-1β release and inflammation induced by the apoptosis inducer Fas ligand. Nat Med 1998; 4 (11): 1287-92.
16. Subcommittee for Scleroderma Criteria of the American Rheumatism Association Diagnostic and Therapeutic Criteria Commmittee: Preliminary criteria for the classification of systemic sclerosis (scleroderma). Arthritis Rheum 1980; 23: 581-90.
17. Kahaleh MB, Suttany GL, Smith EA, et al.: A modified scleroderma skin score method. Clin Exp Rheumatol 1986; 4: 367-9.
18. Martinez FJ: Badania czynnościowe układu oddechowego. W: Khan MG, Lynch JP (red.). Choroby płuc. Diagnostyka i terapia (wyd. 1. polskie, red. W Droszcz). Urban & Partner, Warszawa, 2000.
19. Ouchterlony O: Diffusion-in-gel methods for immunological analysis. In: Callos P, Waxman BH (eds) Progress in Allergy. V: 30. New York, Karger, 1962.
20. Stassi G, Todaro M, Demaria R, et al.: Defective expression of CD95 (Fas/APO-1) molecule suggests apoptosis impairment of T and B cells in HLA-B8, DR3-positive individuals. Human Immunology 1997; 55: 39-44.
21. Szpringer E, Lutnicki K: Znaczenie apoptozy w wybranych chorobach w dermatologii. Nowa Medycyna 2002; 116: 24-32.
22. Czuwara J, Makieła B, Nowicka U i wsp.: Apoptoza w komórkach jednojądrowych krwi obwodowej pacjentów z twardziną układową. Przegl Dermatol 1996; 83: 461-6.
23. Zhivotovsky B, Samali A, Gahm A, et al.: Caspase: their intracellular localization and translocation during apoptosis. Cell Death Differ 1999; 8: 644-51.
24. Wang S, Miura M, Yung Y-K, et al.: Murine caspase-11, an ICE-interacting protease, is essential for the activation of ICE. Cell 1998; 92: 501-9.
25. Grzegorczyk J: Apoptoza – udział w rozwoju zapalenia alergicznego. Alergia Astma Immunologia 2003; 8: 20-3.
26. Grzegorczyk J, Kowalski ML, Piłat A, et al.: Increased apoptosis of peripheral blood mononuclear cells in patients with perinnial allergic asthma/rhinitis: relation to serum markers of apoptosis. Mediators Inflamm 2002; 11: 225-33.
27. Kowalski ML, Grzegorczyk J, Pawliczak R, et al.: Decreased apoptosis and distinct profile of infiltrating cells in the nasal polyps of patients with aspirin hypersensitivity. Allergy 2002; 57: 493-500.