Original article
Serum levels of metalloproteinases-2 and -9 (MMP-2, MMP-9) – correlation with their expression in skin lesions in systemic sclerosis – the preliminary examination

Wprowadzenie
Patogeneza twardziny układowej jest złożona i nie do końca wyjaśniona. W rozwoju tej choroby bierze prawdopodobnie udział wiele różnych, wzajemnie na siebie oddziałujących czynników. Nadmierne gromadzenie kolagenu w twardzinie układowej, stwierdzane nie tylko w skórze, ale również w narządach wewnętrznych (przewód pokarmowy, płuca, serce, nerki), spowodowane jest m.in. wzmożonym odkładaniem kolagenu I, III, V, VI, VII, fibronektyny i tenascyny wokół naczyń, na granicy skóry właściwej i tkanki podskórnej [1, 2]. Homeostaza tkanki łącznej w twardzinie układowej regulowana jest m.in. przez równowagę pomiędzy produkcją i degradacją składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Liczba składników macierzy zewnątrzkomórkowej (extracellular matrix – ECM) zależna jest od równowagi pomiędzy degradującymi je enzymami a ich tkankowymi inhibitorami. Dotychczas poznano dość dokładnie rolę tych czynników w szerzeniu się procesów nowotworowych [3–7], toczniu rumieniowatym układowym, reumatoidalnym zapaleniu stawów [8] czy tworzeniu keloidów [9]. Metaloproteinazy należą do enzymów rozkładających składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, których aktywność wiąże się z obecnością aktywnych jonów cynku i wapnia. MMPs są syntetyzowane i wydzielane przez wiele różnych komórek, takich jak fibroblasty, monocyty, granulocyty, limfocyty T, dendrytyczne komórki Langerhansa, makrofagi, komórki śródbłonka, komórki nabłonkowe, miocyty, neurony i astrocyty, a także keratynocyty [10, 11, 12]. Metaloproteinazy różnią się między sobą substratami, w stosunku do których wykazują właściwości trawiące. Metaloproteinaza 2 (MMP-2) jest żelatynazą A o ciężarze cząsteczkowym 72 kDa, wykazuje zdolność degradacji kolagenu typu I, IV, V, VII, X, XI, XIV, żelatyny, elastyny, fibronektyny, agrekanu, osteonektyny, lamininy 1, 5, metaloproteinaz 1, 9, 13. Natomiast metaloproteinaza 9 (MMP-9) o ciężarze cząsteczkowym 92 kDa, zwyczajowo nazywana żelatynazą B, ma zdolność trawienia kolagenu typu IV, V, VII, X, XIV, żelatyny, entaktyny, agrekanu, elastyny, fibronektyny, osteonektyny, plazminogenu oraz IL-1β [2]. Wykazano, że zarówno metaloproteinazy macierzy, jak i ich tkankowe inhibitory odgrywają istotną rolę w przebiegu procesów zapalnych [13, 14]. Dotychczasowe wyniki badań podkreślają udział metaloproteinaz w patogenezie twardziny układowej, jednakże ich rola nie została dokładnie poznana. Celem niniejszej pracy była ocena stężenia w surowicy chorych na twardzinę układową żelatynaz – MMP-2 i MMP-9, a także ich ekspresji w chorobowo zmienionej skórze, oraz porównanie z wynikami uzyskanymi w grupie kontrolnej.
Materiał i metody

Pacjenci
Do grupy badanej zakwalifikowano 10 chorych z twardziną układową, 6 z postacią ograniczoną – limited SSc (lSSc), i 4 z postacią uogólnioną choroby – difusse SSc (dSSc). Wśród pacjentów było 9 kobiet i 1 mężczyzna, średni wiek chorych wynosił 54,4 roku (38–72 lat). Rozpoznanie choroby postawiono w oparciu o kryteria diagnostyczne twardziny układowej Amerykańskiego Instytutu Reumatologii (American College of Rheumatology – ACR) [15]. Stopień stwardnienia skóry oceniano za pomocą skali punktowej wg Kahaleha i wsp. [16]. Grupę kontrolną stanowiło 10 zdrowych ochotników (5 kobiet i 5 mężczyzn), w wieku 19–49 lat (średni wiek 42 lata). U wszystkich pacjentów przeprowadzono podstawowe badania laboratoryjne, w tym odczyn Biernackiego, morfologię, badanie ogólne moczu oraz poziom mocznika i kreatyniny. Wykonano ponadto badania specjalistyczne: scyntygrafię przełyku, 24-godzinne badanie EKG (holter), echokardiografię metodą Dopplera, zdjęcie RTG klatki piersiowej, kości stóp i rąk oraz badanie spirometryczne. Obecność przeciwciał przeciwjądrowych (antinuclear antibodies – ANA) w surowicy oceniano, stosując metodę pośredniej immunofluorescencji (indirect immunofluorescence – IIF) z wykorzystaniem komórek HEp-2 jako substratu (Sigma Diagnostics). Szczegółowe określenie rodzaju przeciwciał przeprowadzono za pomocą metody podwójnej immunodyfuzji (double immunodiffusion – DID) w żelu agarowym wg Ouchterlony’ego [17]. Przed rozpoczęciem oznaczeń wszyscy pacjenci oraz osoby z grupy kontrolnej wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu. Projekt badawczy uzyskał akceptację Komisji Bioetycznej przy Uniwersytecie Medycznym w Łodzi.
Charakterystyka chorych
Średni czas trwania objawu Raynauda wynosił 9,7 roku (w zakresie od 4 do 20 lat), a czas utrzymywania się stwardnień skóry – 5,4 roku (od 1 do 15 lat). Średni stopień nasilenia zmian skórnych (Total Skin Score – TSS) to 15 pkt, w zakresie od 10 do 28 pkt. Procesem chorobowym objętych było 1–3 narządów wewnętrznych. Przeciwciała Scl 70 stwierdzono w surowicy 5 z 10 chorych na twardzinę układową, obecność przeciwciał U3RNP – w 1 przypadku podtypu lSSc twardziny; u 4 pozostałych chorych występowały inne, nieswoiste przeciwciała przeciwjądrowe.
Surowica
Pobrane próbki surowicy były natychmiast zamrażane w temp. -20^oC. Określenie stężeń MMP-2 i MMP-9 przeprowadzono z wykorzystaniem metody immunoenzymatycznej ELISA.
Badania tkankowe
Wycinki ze skóry chorobowo zmienionej (n=10) utrwalono w formalinie i zatopiono w bloczkach parafinowych. Pobrano ponadto wycinki ze skóry przedramion od 10 zdrowych ochotników, dobranych odpowiednio do osób z grupy badanej pod względem płci i wieku.
Immunohistochemia
Skrawki zatopione w parafinie (o grubości 3–4 µm) poddano rutynowemu barwieniu hematoksyliną i eozyną oraz barwieniu immunohistochemicznemu z zastosowaniem systemu DAKO EnVision metodą immunoperoksydazową. Zastosowano mysie przeciwciała monoklonalne anty-MMP-2 i anty-MMP-9 (Novocastra). W celu wykonania barwień immunohistochemicznych skrawki zatopione w parafinie umieszczono na szkiełkach adhezyjnych i suszono przez 24 godz. w temperaturze 56°C. W następnym etapie skrawki poddano odparafinowaniu w szeregu ksylenów i alkoholi o zmniejszających się stężeniach (96, 80, 70 i 60%). Aktywność endogennej peroksydazy zahamowano, zanurzając skrawki w 3% roztworze nadtlenku wodoru w metanolu. W celu odzyskania antygeniczności tkanek i umożliwienia ich reakcji z przeciwciałami zastosowano swoiste procedury dla każdego przeciwciała, zgodnie z zaleceniami producenta. Po 60-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej z rozcieńczonymi przeciwciałami, szkiełka 3-krotnie przemyto w buforze TRIS. Następnie zastosowano system podwójnej wizualizacji DAKO EnVision w celu uwidocznienia reakcji antygen-przeciwciało. W przypadkach, w których wystąpił dodatni odczyn w barwieniu immunohistochemicznym, podbarwiano jądra komórkowe hematoksyliną Meyera przez 2 min. Po odwodnieniu i przeprowadzeniu przez szereg acetonów i ksylenów, podobnie jak opisano powyżej, utrwalono szkiełka w balsamie kanadyjskim. Do oceny stopnia intensywności reakcji immunohistochemicznej zastosowano 3-stopniową skalę półilościową: • I stopień (słaby odczyn) – reakcja immunohistochemiczna była ograniczona do pojedynczych komórek nabłonka i/lub występowała tylko ogniskowo w podścielisku, • II stopień (umiarkowany odczyn) – reakcja barwna występowała w części komórek nabłonkowych i/lub w niektórych obszarach podścieliska, • III stopień (silny odczyn) – reakcja immunohistochemiczna zachodziła w licznych komórkach nabłonka i/lub w dużych obszarach podścieliska. Ekspresję MMPs oceniało dwóch niezależnych patologów przy użyciu mikroskopu Nikon Microfob FXA (Nikon LTD, Japonia) w powiększeniu 100 razy.
Analiza statystyczna
Dla cech mierzalnych podano zakresy (minimum-maksimum), przeliczono wartości przeciętne – średnie arytmetyczne, medianę. Obliczono wewnętrzne zróżnicowanie cech za pomocą odchylenia standardowego. Rozkład badanych zmiennych oceniono za pomocą testu Shapiro-Wilka. Wartości przeciętne w analizowanych grupach porównywano, wykorzystując test Manna-Whitneya. Zależności pomiędzy dwiema cechami mierzalnymi oceniano, wykorzystując współczynnik rang Spearmana – ρ. We wszystkich porównaniach poziom istotności ustalono dla p<0,05.
Wyniki
Czas trwania objawu Raynauda wynosił w całej grupie SSc 4–20 lat (średnio 9,7 roku), w podgrupie lSSc 7–20 lat (średnio 11,5 roku), w dSSc 4–10 lat (średnio 7 lat). Czas trwania choroby wynosił w grupie chorych z SSc – od roku do 16 lat (średnio 5,4 roku), w lSSc od roku do 16 lat (średnio 6,3 roku), a w dSSc 3–5 lat (średnio 4 lata). Stopień stwardnienia skóry Total Skin Score (TSS) to w SSc 10–28 pkt (średnio 15 pkt), w lSSc 10–16 pkt (średnio 12 pkt), a w dSSc 12–28 pkt (średnio 19,5 pkt) (tab. 1.). W tab. 2. i 3. przedstawiono wyniki oznaczenia stężeń MMP-2 i MMP-9 w surowicy badanych pacjentów. Średnie stężenie MMP-2 w surowicy badanych chorych nie różniło się istotnie w porównaniu z grupą kontrolną (246,4 ng/ml vs 248,0 ng/ml). Porównanie średnich wartości stężenia MMP-2 w surowicy chorych z obu postaciami klinicznymi również nie wykazało różnic – w podgrupie z limited SSc wynosiło 245,2 ng/ml, a w diffuse SSc – 248,0 ng/ml (tab. 4.). Wykazano, że średnie stężenie MMP-9 w surowicy w badanej grupie chorych było znamiennie wyższe 857,7 ng/ml w porównaniu z wynikami uzyskanymi w grupie kontrolnej: 431,1 ng/ml (p<0,05). U 5 chorych (3 z limited SSc i 2 z diffuse SSc) stwierdzono podwyższone stężenie MMP-9 (953–2306 ng/ml) w porównaniu z wynikami uzyskanymi w grupie kontrolnej (169–705 ng/ml). Porównanie wartości średnich stężenia MMP-9 w surowicy chorych z postacią limited SSc (837,2 ng/ml) i dSSc (888,5 ng/ml) nie wykazało różnic statystycznie znamiennych (p>0,05) (tab. 4.). Badanie immunohistochemiczne ujawniło ekspresję MMP-2 w okolicy naczyń krwionośnych i w skórze właściwej w 9 wycinkach, w tym w 2 wycinkach obecna ona była również w komórkach warstwy podstawnej naskórka (ryc. 1.). W 1 wycinku ekspresja zlokalizowana była tylko w skórze właściwej i komórkach warstwy podstawnej naskórka. Ekspresja ta była silnego (6 wycinków) lub średniego stopnia (4 wycinki) (tab. 3.). Ekspresja MMP-9 w skórze obserwowana w okolicy naczyń krwionośnych i w komórkach warstwy podstawnej naskórka w 8 wycinkach była średnio nasilona (ryc. 2.), w tym w 3 wycinkach obecna również w skórze właściwej (tab. 3.). Ekspresję MMP-2 i MMP-9 w 10 wycinkach pobranych od zdrowych ochotników oceniano przy użyciu tych samych metod. We wszystkich skrawkach wykazano umiarkowaną ekspresję obu białek tylko w nielicznych keratynocytach warstwy podstawnej naskórka (ryc. 3.). W 4 wycinkach stwierdzono słabą ekspresję badanych metaloproteinaz w okolicy mieszków włosowych. U chorych ze stężeniem MMP-9 w surowicy mieszczącym się w granicach podobnych, jak u osób zdrowych, średni czas trwania objawu Raynauda wynosił 10,6 roku, a u pacjentów z wyższymi stężeniami MMP-9 w surowicy wynosił 8,8 roku. Średni czas trwania stwardnień skóry w obu podgrupach wynosił – u chorych z podwyższonymi stężeniami MMP-9 w surowicy – 3,2 roku, a u chorych z wartościami w granicach podobnych, jak w grupie kontrolnej – 7,6 roku. Stopień stwardnienia skóry u chorych z podwyższonymi wartościami MMP-9 wynosił średnio 17,6 pkt, a w podgrupie z niższymi wartościami MMP-9 w surowicy średnio – 12,4 pkt (tab. 2.). Wykazano statystycznie istotną zależność pomiędzy stężeniem metaloproteinazy 9 a czasem trwania stwardnień skóry; wartość ta obniżała się wraz z czasem trwania choroby (ρ=-0,860, p<0,02) (tab. 5., ryc. 4.). Pozostałe zależności nie były statystycznie znamienne.
Omówienie wyników i dyskusja
W piśmiennictwie pojawia się coraz więcej informacji o czynnikach wpływających na skład macierzy zewnątrzkomórkowej. Zaburzenie równowagi pomiędzy czynnikami degradującymi składniki ECM a ich inhibitorami odgrywa rolę w patogenezie wielu schorzeń. Wykazano, że zwiększona ekspresja szeregu metaloproteinaz związana jest z progresją nowotworów [3–7, 18], rozwojem włóknienia mięśnia sercowego w izolowanej stenozie aortalnej [19], chorób naczyń mózgowych [20, 21], cukrzycy typu 1 [22, 23], alergicznego nieżytu nosa [24], reumatoidalnego zapalenia stawów [8,25,26], tocznia rumieniowatego układowego [27], a także tworzeniem keloidów [9, 28]. Zmniejszenie ekspresji MMP-13 obserwowano natomiast w endometriozie [29]. W chorobach pęcherzowych, takich jak pemfigoid i dermatitis herpetiformis wykazano, że metaloproteinazy – zarówno rozpuszczalne, jak i związane z błoną komórkową – biorą udział w degradacji błony podstawnej, dlatego też mogą być przyczyną tworzenia się zmian o charakterze pęcherzy. Proces włóknienia w przebiegu twardziny układowej ma wieloczynnikowe podłoże i jest wynikiem nie tylko procesu zapalnego czy zaburzeń immunologicznych i naczyniowych, ale również nadmiernego wytwarzania, odkładania kolagenu i innych składowych ECM w tkance łącznej. Wyniki badań wielu autorów wskazują na udział metaloproteinaz i ich inhibitorów w tym procesie [10, 30–32]. Do grupy enzymów degradujących składniki ECM należą kolagenazy, żelatynazy, elastazy, stromelizyny i metaloproteinazy typu błonowego [33]. Istotny wpływ na skład macierzy zewnątrzkomórkowej mają m.in. żelatynazy – metaloproteinaza 2 (MMP-2) i 9 (MMP-9), które degradują zdenaturowany kolagen i składniki błony komórkowej [22, 34]. MMP-2, produkowana przez fibroblasty i makrofagi, rozszczepia żelatyny, kolagen typu VI, fibronektyny i proteoglikany [10]. Metaloproteinaza 9 w zdrowych tkankach wraz z innymi enzymami wpływa na prawidłową przemianę kolagenu typu IV, V, elastyny i zdenaturowanego kolagenu. W przebiegu procesów zapalnych wykazano, że w wyniku stymulacji cytokin prozapalnych dochodzi do nadmiernego wydzielania metaloproteinaz, w tym MMP-9, w komórkach nacieku zapalnego [35]. Badania doświadczalne przeprowadzone na myszach wykazały także, że MMP-9 odgrywa rolę w przebiegu angiogenezy [36], jak również w rozwoju glomerulosclerosis [37], encephalomyelitis [38], tętniaka aorty [39] i w zawale serca [40]. Produkcja metaloproteinaz regulowana jest przez cytokiny, czynniki wzrostu, reakcje komórka-komórka i komórka-macierz, a także procesy kontrolujące ekspresję genów i aktywację ich proenzymatycznych form. Swoiste inhibitory tkankowe wpływają również na aktywność MMPs. Dotychczasowe badania zmierzające zarówno do określenia znaczenia metaloproteinaz w patogenezie twardziny układowej, jak i oznaczania ich stężenia w ocenie aktywności choroby prowadzone były jedynie na podstawie określenia ich stężeń w surowicy lub ekspresji w hodowlach fibroblastów pochodzących od badanych pacjentów. Ich wyniki nie są jednoznaczne. Kikuchi i wsp. [41] wykazali, że stężenie metaloproteinazy 9 (MMP-9) było statystycznie niższe w surowicy chorych na twardzinę układową w porównaniu z grupą kontrolną, a także niższe w postaci dSSc niż lSSc. Autorzy stwierdzili również ujemną korelację ze stopniem stwardnienia skóry. Nie stwierdzono jednakże zależności pomiędzy jej stężeniem a stężeniem inhibitora – TIMP-1. Bogaczewicz i wsp. [42] wykazali, że w surowicy chorych na twardzinę układową zarówno typu dSSc, jak i lSSc stężenie metaloproteinazy 9 było wysokie. Obserwowali również wyższe stężenie tej metaloproteinazy w surowicy osób chorujących krócej niż u pacjentów w późniejszym etapie choroby, dlatego też wysunięto hipotezę o możliwości odzwierciedlenia dynamizmu procesu przemian ECM w SSc za pomocą oznaczania stężeń tej metaloproteinazy. Autorzy nie stwierdzili natomiast istotnego związku pomiędzy występowaniem zmian narządowych a wysokim stężeniem MMP-9 w surowicy badanych chorych. W przeprowadzonych badaniach wykazano, że stężenia w surowicy badanych chorych metaloproteinazy 2 były porównywalne, a metaloproteinazy 9 – znamiennie wyższe w porównaniu z wynikami uzyskanymi w grupie kontrolnej. Kobayashi i wsp. (2003) wykazali, że żelatynazy – metaloproteinaza 2 i 9, wydzielane przez fibroblasty mogą odgrywać ważną rolę w zapaleniu indukowanym przez cytokiny i metabolizmie tkankowym [43]. Enzymy te mogą brać udział w aktywacji latentnej formy TGF-b – cytokiny, której przypisuje się również istotne znaczenie w patogenezie twardziny układowej [18]. Badania Giannelli i wsp. (2005) wskazują natomiast, że obniżone stężenie metaloproteinazy 9 w większym stopniu odzwierciedla zaburzenia w pierwotnym nadciśnieniu płucnym u chorych z SSc [44]. W badaniach autorów niniejszej pracy w wycinkach skóry pochodzących od chorych na twardzinę układową stwierdzono wyraźną ekspresję metaloproteinaz 2 i 9 w porównaniu z wycinkami pochodzącymi od osób zdrowych. Ekspresja MMP-2 zlokalizowana była w skórze właściwej i naczyniach krwionośnych, natomiast MMP-9 w większości badanych wycinków stwierdzana była w naskórku i w naczyniach krwionośnych skóry właściwej. Wykazano, że charakter ekspresji MMP-2 był silny, a MMP-9 średni. Można przypuszczać, że obecność zwiększonej ekspresji większości badanych metaloproteinaz w naczyniach krwionośnych skóry właściwej potwierdza ich znaczącą rolę w degradacji składników podśródbłonkowej błony podstawnej, co ułatwia przenikanie limfocytów T do tkanek otaczających i daje możliwość ich pośredniego wpływu na zwiększoną produkcję składników ECM przez fibroblasty. Badania innych autorów wskazują, że ekspresja żelatynaz (MMP-2 i MMP-9) ułatwia limfocytom T przekraczanie podśródbłonkowej błony podstawnej [45]. Pobudzone limfocyty mogą na drodze interakcji komórka-komórka w bezpośredni sposób indukować ekspresję MMP-9 w fibroblastach [46], neutrofilach [47] i monocytach [48]. W przeprowadzonych obecnie badaniach nie stwierdzono związku pomiędzy nasileniem ekspresji metaloproteinaz 2 i 9 a czasem trwania choroby, chociaż znane są wyniki badań potwierdzających istnienie takich zależności w stosunku do surowiczych stężeń metaloproteinaz. Kuroda i Shinkai (1997) wykazali zależność ekspresji genów metalopreoteinaz związaną z czasem trwania choroby (badania przeprowadzone in vitro – porównanie fibroblastów pobranych od chorych na twardzinę i prawidłowych fibroblastów) [49]. Ekspresja MMP była większa w fibroblastach pobranych od pacjentów chorujących krócej niż rok; w przypadku pacjentów chorujących dłużej (2–4 lata) poziom m-RNA MMP-1, MMP-2 i MMP-3 był niski. W fibroblastach osób chorujących ponad 6 lat ekspresja MMP nie różniła się od ekspresji stwierdzonej u osób zdrowych. W twardzinie układowej nie można jednak dokładnie wyjaśnić mechanizmu zaburzeń równowagi pomiędzy metaloproteinazami i ich tkankowymi inhibitorami doprowadzających do nadmiernego włóknienia. Sugeruje się, że nadmierna produkcja ECM może być również wynikiem zahamowania aktywności MMPs. Badania niektórych autorów wskazują na udział w tym procesie przeciwciał skierowanych przeciwko metaloproteinazom 1 i 3, które stwierdzono w surowicy chorych na twardzinę układową [50, 51]. Potwierdzeniem hipotezy o wpływie MMPs i TIMPs na skład ECM nie tylko poprzez regulację ich wytwarzania przez fibroblasty, ale również przez ich znaczenie w rozwoju zapalenia może być fakt, iż w badanych wycinkach skóry pochodzących od chorych na twardzinę układową stwierdzono wyraźną ekspresję MMP-2 w komórkach nacieku zapalnego – eozynofilach i neutrofilach. Najbardziej intensywny charakter miała ekspresja MMP-2. Uzyskane wyniki potwierdzają dotychczasowe obserwacje, wskazujące na znaczący udział zaburzeń równowagi pomiędzy czynnikami degradującymi składniki macierzy zewnątrzkomórkowej a ich inhibitorami w rozwoju włóknienia tkankowego w twardzinie układowej.
Praca badawcza była finansowana z funduszów prac statutowych Nr 503-8019-1; 503-1019-1, oraz pracy własnej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi 502-18-344. Szczególne podziękowania za pomoc techniczną pragniemy złożyć paniom Grażynie Jastrzębskiej i Stanisławie Madalińskiej.

Piśmiennictwo:
1. Varga J, Bashey RI. Regulation of connective tissue synthesis in systemic sclerosis. Int Rev Immunol 1995; 12: 187-99. 2. Bogaczewicz J, Chodorowska G, Krasowska D. Rola metaloproteinaz macierzy i tkankowych inhibitorów metaloproteinaz w progresji nowotworów skóry a nowe strategie farmakologicznej inhibicji metaloproteinaz macierzy. Przeg Dermatol 2004; 91: 153-60. 3. Graesslin O, Cortez A, Uzan C, et al. Endometrial tumor invasiveness is related to metalloproteinase 2 and tissue inhibitor of metalloproteinase 2 expressions. Int J Gynecol Cancer 2006; 16: 1911-17. 4. Pesta M, Holubec L Jr, Topolcan O, et al. Quantitative estimation of matrix metalloproteinases 2 and 7 (MMP-2, MMP-7) and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases 1 and 2 (TIMP-1, TIMP-2) in colorectal carcinoma tissue samples. Anticancer Res 2005; 25: 3387-91. 5. Gu ZD, Li JY, Li M, et al. Matrix metalloproteinases expression correlates with survival in patients with esophageal squamous cell carcinoma. Am J Gastroenterol 2005; 100: 1835-43. 6. Bjornland K, Flatmark K, Pettersen S, et al. Matrix metalloproteinases participate in osteosarcoma invasion. J Surg Res 2005; 127: 151-6. 7. Redondo P, Lloret P, Idoate M, Inoges S. Expression and serum levels of MMP-2 and MMP-9 during human melanoma progression. Clin Exp Dermatol 2005; 30: 541-5. 8. Rannou F, Francois M, Corvol MT, Berenbaum F. Cartilage breakdown in rheumatoid arthritis. Joint Bone Spine 2005; 73: 29-36. 9. Fujiwara M, Muragaki Y, Ooshima A. Keloid-derived fibroblasts show increased secretion of factors involved in collagen turnover and depend on matrix metalloproteinase for migration. Br J Dermatol 2005; 153: 295-300. 10. Yazawa N, Kikuchi K, Ihn H, et al. Serum levels of tissue inhibitor of metalloproteinase 2 in patients with systemic sclerosis. J Am Acad Dermatol 2000, 42: 70-5. 11. Saarialho-Kere U, Kerkela E, Jahokola T, et al. Epsilin (MMP-28) expression is associated with cell proliferation during epithelial repair. J Invest Dermatol 2002; 119: 14-21. 12. Krampert M, Bloch W, Sasaki T, Werner S. Activities of the matrix metalloproteinase stromelysin-2 (MMP-10) in matrix degradation and keratinocyte organization in wounded skin. Mol Biol Cell 2004; 15: 5242-54. 13. Carmichael DF, Stricklin GP, Stuart JM. Systemic administration of TIMP in the treatment of collagen-induced arthritis in mice. Agents Actions 1989; 27: 378-9. 14. Lee MM, Yoon BJ, Osiewicz K, et al. Tissue inhibitor of metalloproteinase 1 regulates resistance to infection. Infect Immun 2005; 73: 661-5. 15. Subcommittee for scleroderma criteria of the American Rheumatism Association Diagnostic and Therapeutic Criteria Committee. Preliminary criteria for the classification of systemic sclerosis (scleroderma). Arthritis Rheum 1980; 23: 581-90. 16. Kahaleh MB, Sultany GL, Smith EA, et al. A modified scleroderma skin scoring method. Clin Exp Rheumatol 1986; 4: 367-69. 17. Ouchterlony O. Diffusion-in-gel methods for immunological analysis. In: Progress in Allergy. Callos P, Waxman BH (eds.). Karger, New York 1962; V: 30. 18. Yu Q, Stamenkovic I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev 2000; 14: 163-76. 19. Tamarina NA, McMillan WD, Shively VP, Pearce WH. Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in aneurysms and normal aorta. Surgery 1997; 122: 264-71. 20. Van den Steen PE, Van Aelst I, Starckx S, et al. Matrix metalloproteinases, tissue inhibitors of MMPs and TACE in experimental cerebral malaria. Lab Invest 2006; 86: 873-88. 21. Krizanac-Bengez L, Hossain M, Fazio V, et al. Loss of flow induces leukocyte-mediated MMP/TIMP imbalance in dynamic in vitro blood-brain barrier model: role of pro-inflammatory cytokines. Am J Physiol Cell Physiol 2006; 291: C740-9. 22. Annala A, Koivukangas V, Salmela P, et al. Collagen synthesis markers and matrix metalloproteinases 2 (MMP-2) and 9 (MMP-9) in the suction blister fluid and serum of juvenile diabetic patients. Eur J Dermatol 1995; 5/3: 247-52. 23. Chung AW, Hsiang YN, Matzke LA, et al. Reduced expression of vascular endothelial growth factor paralleled with the increased angiostatin expression resulting from the upregulated activities of matrix metalloproteinase-2 and -9 in human type 2 diabetic arterial vasculature. Circ Res 2006; 99: 140-8. 24. Kostamo K, Sorsa T, Leino M, et al. In vivo relationship between collagenase-2 and interleukin-8 but not tumour necrosis factor-alpha in chronic rhinosinusitis with nasal polyposis. Allergy 2005; 60: 1275-9. 25. Abeles AM, Pillinger MH. The role of the synovial fibroblast in rheumatoid arthritis – cartilage destruction and the regulation of matrix metalloproteinases. Bull NYU Hosp Jt Dis 2006; 64: 20-4. 26. Fiedorczyk M, Klimiuk PA, Sierakowski S, et al. Serum matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with early rheumatoid arthritis. J Rheumatol 2006; 33: 1523-9. 27. Toubi E, Kessel A, Grushko G, et al. The association of serum matrix metalloproteinases and their tissue inhibitor levels with scleroderma disease severity. Clin Exp Rheumatol 2002; 20: 221-4. 28. Fujiwara M, Muragaki Y, Ooshima A. Keloid-derived fibroblasts show increased secretion of factors involved in collagen turnover and depend on matrix metalloproteinase for migration. Br J Dermatol 2005; 153: 295-300. 29. Laudanski P, Szamatowicz J, Ramel P. Matrix metalloproteinase-13 and membrane type-1 matrix metalloproteinase in peritoneal fluid of women with endometriosis. Gynecol Endocrinol 2005; 21: 106-10. 30. Takeda K, Hatamochi A, Ueki H, et al. Decreased collagenase expression in cultured systemic sclerosis fibroblasts. J Invest Dermatol 1994; 103: 359-63. 31. Kikuchi K, Kadono T, Furue M, et al. Tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1) may be an autocrine growth factor in scleroderma fibroblasts. J Invest Dermatol 1997; 108: 281-94. 32. Mattila L, Airola K, Ahonen M, et al. Activation of tissue inhibitor of metalloproteinases-3 (TIMP-3) mRNA expression in scleroderma skin fibroblasts. J Invest Dermatol 1998; 110: 416-21. 33. Kahari VM, Saarialho-Kere U. Matrix metalloproteinases in skin. Exp Dermatol 1997; 6: 199-213. 34. Bullen EC, Longaker MT, Updike DL, et al. Tissue inhibitor of matalloproteinase-1 is decreased and activated gelatinases are increased in chronic wounds. J Invest Dermatol 1995; 104: 236-40. 35. Ingman T, Tervahartiala T, Ding Y, et al. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in gingival cervicular fluid and saliva of periodontitis patients. J Clin Periodontol 1996; 23: 1127-32. 36. Vu TH, Shipley JM, Bergers G, et al. MMP-9/gelatinase B is a key regulator of growth plate angiogenesis and apoptosis of hypertrophic chondrocytes. Cell 1998; 93: 411-22. 37. Fornoni A, Wang Y, Lenz O, et al. Association of a decreased number of d (CA) repeats in the matrix metalloproteinase-9 promoter with glomerulosclerosis susceptibility in mice. J Am Soc Nephrol 2002; 13: 2068-76; erratum in: J Am Soc Nephrol 2002; 13: 2617. 38. Dubois B, Masure S, Hurtenbach V, et al. Resistance of young gelatinase-deficient mice to experimental autoimmune encephalomyelitis and necrotizing tail lesions. J Clin Invest 1999; 104: 1507-15. 39. Pyo R, Lee JK, Shipley JM, et al. Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms. J Clin Invest 2000; 105: 1641-9. 40. Ducharme A, Frantz S, Aikawa M, et al. Targeted deletion of matrix metalloproteinase-9 attenuates left ventricular enlargement and collagen accumulation after experimental myocardial infarction. J Clin Invest 2000; 106: 55-62. 41. Kikuchi K, Kubo M, Hoashi T, et al. Decreased MMP-9 activity in the serum of patients with diffuse cutaneous systemic sclerosis. Clin Exp Dermatol 2002; 27: 301-5. 42. Bogaczewicz J, Krasowska D, Stryjecka-Zimmer M, Chodorowska G. High serum total concentration of matrix metalloproteinase-9 (pro-MMP-9 i MMP-9) in patients with systemic sclerosis. Przegl Dermatol 2005; 3: 217-23. 43. Kobayashi T, Hattori S, Shinkai H. Matrix metalloproteinases -2 and -9 are secreted from human fibroblasts. Acta Derm Venereol 2003; 83: 105-7. 44. Giannelli G, Iannone F, Marinosci F, et al. The effect of bosentan on matrix metalloproteinase-9 levels in patients with systemic sclerosis-induced pulmonary hypertension. Curr Med Res Opin 2005; 21: 327-32. 45. Leppert D, Waubant E, Galardy R, et al. T cell gelatinases mediate basement membrane transmigration in vitro. J Immunol 1995; 154: 4379-89. 46. Burger D, Rezzonico R, Li JM, et al. Imbalance between interstitial collagenase and tissue inhibitor of metalloproteinases 1 in synoviocytes and fibroblasts upon direct contact with stimulated T lymphocytes: involvement of membrane-associated cytokines. Arthritis Rheum 1998; 41: 1748-59. 47. Zhang JH, Ferrante A, Arrigo AP, et al. Neutrophil stimulation and priming by direct contact with activated human T lymphocytes. J Immunol 1992; 148: 177-81. 48. Lacraz S, Isler P, Vey E, et al. Direct contact between T lymphocytes and monocytes is a major pathway for induction of metalloproteinase expression. J Biol Chem 1994; 269: 22027-33. 49. Kuroda K, Shinkai H. Gene expression of types I and III collagen, decortin, matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in skin fibroblasts from patients with systemic sclerosis. Arch Dermatol Res 1997; 289: 567-72. 50. Sato S, Hayakawa I, Hasegawa M, et al. Function blocking autoantibodies against matrix metalloproteinase-1 in patients with systemic sclerosis. J Invest Dermatol 2003; 4: 542-7. 51. Nishijima C, Hayakawa I, Matsushita T, et al. Autoantibody against matrix metalloproteinase-3 in patients with systemic sclerosis. Clin Exp Immunol 2004; 138: 357-63.