Original paper
Gene preparations encoding angiogenic factors effectively stimulate skin neovascularization and hair growth

Wprowadzenie
W zapoczątkowanych pod koniec lat 80. ubiegłego wieku próbach leczenia chorych metodami terapii genowej wykorzystuje się wirusowe lub niewirusowe preparaty genowe. Są to najczęściej wektory DNA niosące wybrane geny – kodujące, odpowiedzialne za efekt biologiczny, terapeutyczne białka. W obecnie przeprowadzanych badaniach klinicznych terapii genowej na świecie (ok. 40%) stosuje się wektory konstruowane na podstawie cząsteczki plazmidowego DNA [1]. Najczęściej wykorzystuje się plazmidy kodujące czynniki wzrostowe i ich receptory, regulatory cyklu komórkowego i apoptozy, czynniki decydujące o przebiegu angiogenezy [1, 2]. Geny – preparaty genowe – wprowadzane są najczęściej do tkanek, narządów dobrze dostępnych dla badacza, czyli mięśni, skóry i powierzchniowo umiejscowionych guzów nowotworowych [2, 3]. Bardzo często z uwagi na niską wydajność transfekcji genów in vivo plazmidowe DNA kompleksuje się z polimerami kationowymi, które – jak wykazują prace – ułatwiają wnikanie DNA do komórek [4]. Do nośników skutecznie zwiększających wydajność wprowadzania genów in vivo, także do skóry, zalicza się np. rozgałęzione lub liniowe polimery polietylenoiminowe (PEI) [4, 5]. Powstawanie naczyń krwionośnych oparte na strukturach już istniejących – angiogeneza – jest procesem złożonym, wieloetapowym, o którego przebiegu decyduje wypadkowa oddziaływania czynników angiogennych i antyangiogennych oraz środowiska tkankowego (komórki śródbłonkowe, fibroblasty, adipocyty, miocyty, makrofagi, monocyty) [6]. Doniesienia kliniczne i eksperymentalne wskazują, że naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (ang. vascular endothelial growth factor – VEGF), fibroblastyczny czynnik wzrostu (ang. fibroblast growth factor – FGF) czy stromalny czynnik wzrostu (ang. stromal derived factor – SDF) mają silne właściwości proangiogenne – stymulują proliferację, migrację komórek śródbłonkowych, inicjują proces neowaskularyzacji tkankowej [6–8]. Wprowadzanie do wybranych tkanek (skóry, mięśni) genów kodujących czynniki proangiogenne powoduje w następstwie wydajnej transfekcji i ekspresji transgenów powstanie lokalnych gradientów stężeń rekombinowanych białek proangiogennych, które bezpośrednio decydują o przebiegu procesu neowaskularyzacji in vivo [9]. Jak pokazują wstępne badania, poprawa stanu klinicznego pacjentów leczonych preparatami genowymi (angiogeneza terapeutyczna) wynika bezpośrednio z neowaskularyzacji indukowanej przez wprowadzane do niedokrwionych tkanek preparaty genowe kodujące czynniki angiogenezy [9, 10]. Próby kliniczne angiogennej terapii genowej wykonuje się również w ośrodkach kardiologicznych w Polsce [11, 12]. Skóra jest rozległym narządem budującym ludzkie ciało. Spełnia wiele podstawowych zadań warunkujących prawidłowe funkcjonowanie organizmu człowieka. Jest aktywną biologicznie powłoką ciała, odgrywa rolę termoregulacyjną, wydzielniczą, a także wydalniczą. Fizjologiczny stan skóry jest wypadkową aktywności wielu narządów, a jej sprawność biologiczna łączy się również z funkcjonalnym ukrwieniem, warunkującym chociażby prawidłowy wzrost włosów. Unaczynienie (ukrwienie) skóry wpływa w decydujący sposób zarówno na jej sprawność biologiczną, jak i przebieg procesów starzenia. Rozwój technologii genowych umożliwia prowadzenie badań poświęconych poszukiwaniu różnorodnych środków leczniczych i skutecznych sposobów terapii. Obecnie możliwe wydaje się np. konstruowanie metodami inżynierii genetycznej ekspresyjnych wektorów plazmidowych poprawiających ukrwienie tkanek, tym samym polepszających czynność biologiczną narządów [10, 13]. Wydaje się prawdopodobne, że obecność plazmidów proangiogennych w badaniach może przyczynić się do rozwiązania wielu problemów ograniczających rozwój transplantologii, medycyny regeneracyjnej, chirurgii plastycznej czy kosmetologii.
Cel
W niniejszej pracy wykorzystano uzyskane drogą klonowania molekularnego wektory ekspresyjne kodujące wybrane, silne białka proangiogenne, takie jak VEGF, FGF oraz SDF. Celem badań była ocena, czy przygotowane proangiogenne preparaty genowe będą stymulować proces neowaskularyzacji w skórze i wzrost włosów. Badania przeprowadzono na myszach laboratoryjnych Balb/c. Zwierzętom śródskórnie podawano DNA plazmidowe czyste lub skompleksowane z nośnikiem polikationowym PEI 25 kDa, efektywnie zwiększającym wydajność transfekcji genów in vivo.
Materiał i metody

Proangiogenne plazmidy
W badaniach wykorzystano uzyskane wcześniej metodą klonowania molekularnego plazmidowe wektory ekspresyjne kodujące czynniki proangiogenne, takie jak pVEGF165, pFGF-2, pSDF-1 oraz wektor pVIF kodujący jednocześnie VEGF165 oraz FGF-2 (wektor bicistronowy) [11]. Wklonowane geny znajdują się pod transkrypcyjną kontrolą promotora cmv. Wektory namnażano w systemie transformowanych bakterii Escherichia coli. Plazmidy izolowano metodą lizy alkalicznej, stosując zestawy do izolacji GigaEndofree (Qiagen). Uzyskane wektory poddawano analizie PCR (ang. polymerase chain reaction) oraz elektroforetycznej. Zastosowano startery o następujących sekwencjach: amp: 5’-ATAGTTGCCTGACTCC-3’, 5’-GTTACATCGAACTGGA-3’; Vegf165: 5’-GCAGAATCATCACGAAGT-3’, 5’-GCCTCGGCTTGTCACA-3’; Fgf-2: 5’-ATGAATTCGCCAGCATTGCCCGAGGAT-3’, 5’-TTCTCGAGATTCAGCTCTTAGCAGACAT-3’; Sdf-1: 5’-AAGAATTCCCATGAACGCCAAGGTCGTG-3’, 5’-AAACTCGAGTGCTTACTT- GTTTAAAGCTTT-3’.
Kompleksy pDNA:PEI 25 kDa
Plazmidowe DNA kompleksowano z PEI 25 kDa (Sigma) w temperaturze pokojowej przez 20 min. Do badań indukcji angiogenezy przygotowano kompleksy zawierające 5 mg pDNA o współczynniku kompleksowania R=0,5, R=5 i R=10, natomiast do badania stymulacji wzrostu włosów wybrano preparaty zawierające 5 mg pDNA i R=5. Współczynnik R oznacza stosunek liczby naładowanych dodatnio grup iminowych polietylenoiminy (N) do ujemnie naładowanych grup fosforanowych plazmidowego DNA (P), N/P=R. Skuteczność kompleksowania, obecność kompleksów pDNA:PEI w uzyskanych preparatach potwierdzono za pomocą analizy elektroforetycznej. Kompleksy przygotowano bezpośrednio przed podaniem zwierzętom laboratoryjnym.
Test skórnej angiogenezy in vivo, ocena wzrostu włosów
Do badań wykorzystano 6–8-tygodniowe myszy Balb/c (samce). Zwierzęta usypiano 3,6-procentowym roztworem wodzianu chloralu i usuwano włosy za pomocą preparatu Nair. Następnie wykonano śródskórne iniekcje wektorów proangiogennych pVEGF165, pFGF-2, pVIF, pSDF-1 (w dawce 5 i 10 mg/0,125 ml 0,9% NaCl) oraz kompleksów wymienionych wektorów z polietylenoiminą 25 kDa (w dawce 5 mg/0,125 ml 0,9% NaCl/PEI, R=0,5, R=5 i R=10). Do iniekcji kontrolnych wykorzystano pusty wektor pEMPTY oraz 0,9-procentowy roztwór NaCl. W celu ułatwienia wizualizacji miejsca wstrzyknięcia preparaty barwiono 0,1-procentowym roztworem błękitu trypanu. Po 72 godz. zwierzęta uśpiono preparatem Morbital, a miejsca wstrzyknięcia analizowano pod lupą (32×), licząc nowe naczynia zgodnie z kryteriami opisanymi przez Sidky’ego i Auerbacha [14]. Części myszy podano śródskórnie preparaty wektorów proangiogennych skompleksowanych z PEI 25 kDa (5 mg/0,125 ml 0,9% NaCl/PEI R=5). Obserwowano wzrost włosów w miejscach iniekcji. W tym celu usunięto włosy preparatem Nair, podano śródskórnie plazmidy, zaznaczając miejsca podania. Pozostawiono następnie myszy na 14 dni, po czym znów usunięto włosy i obserwowano ich pojawianie się w miejscach wstrzyknięcia plazmidów. Wykonano fotografie, usunięto powtórnie włosy z miejsc podania. Pobrano zaznaczone fragmenty skóry, w obszarze którym obserwowano silną angiogenezę i wzrost włosów. Z pobranej tkanki wyizolowano DNA metodą Qiagen (zestaw Midiprep). Analizowano obecność sekwencji plazmidowych metodą PCR.
Wyniki i omówienie wyników
Dynamiczny rozwój nowych technologii farmaceutycznych sprawia, że jest możliwe projektowanie, wytwarzanie i stosowanie w warunkach klinicznych nowych środków leczniczych, również dermatologicznych. Znana w klinice od końca lat 80. ubiegłego wieku terapia genowa wykorzystuje preparaty genowe kodujące białka, spełniające funkcje terapeutyczne. Proangiogenne preparaty genowe zawierają geny czynników silnie stymulujących proces neowaskularyzacji in vivo [9, 10]. Pierwsze próby kliniczne wskazują, że np. proangiogenne wektory plazmidowe silnie pobudzają angiogenezę w mięśniach szkieletowych oraz w sercu pacjentów cierpiących na choroby niedokrwienne [1, 10–12]. Jak przedstawiono na ryc. 1.–5., w wyniku połączenia plazmidowego DNA z polietylenoiminą 25 kDa powstają trwałe kompleksy pDNA:PEI. Analizy elektroforetyczne (test opóźnienia w żelu), widoczne na ryc. 1.–5., panel A, ukazują, że przy stosunku grup iminowych (PEI) do fosforanowych (pDNA) 0,5–10 (R=0,5–10) polimer kationowy PEI całkowicie kompleksuje plazmidowe DNA. Powstałe kompleksy migrują w żelu agarozowym w formie niewidocznych plam. Celem doświadczeń in vivo na zwierzętach była ocena, czy sklonowane plazmidy proangiogenne opłaszczone nośnikiem polietylenoiminowym, czyli struktury o wypadkowym ładunku dodatnim, efektywnie transfekują komórki skóry i pobudzą neowaskularyzację. Myszom laboratoryjnym śródskórnie podawano kompleksy pDNA:PEI o R=0,5, R=5 oraz R=10. Wykazano (ryc. 1.–5.), że PEI ułatwia wnikanie plazmidów proangiogennych do komórek. Wyniki testu angiogenezy skórnej zebrane w tab. 1. wskazują, że stymulacja angiogenezy przez kompleksy pDNA:PEI jest kilkakrotnie wyższa niż czystego plazmidowego DNA – np. wprowadzenie do skóry 5 mg czystego preparatu pVEGF165 powoduje powstanie ok. 8 nowych naczyń krwionośnych, natomiat podanie kompleksu pVEGF165:PEI indukuje powstanie blisko 30 naczyń. Z tab. 1. wynika, że wszystkie sklonowane wektory stymulują proces neoangiogenezy w skórze. Do najsilniej aktywujących powstanie nowych naczyń krwionośnych zaliczyć jednak można wektor pVIF oraz pSDF-1 (ryc. 4., 5.). Wektor pVIF koduje dwa czynniki proangiogenne – naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF165) oraz fibroblastyczny czynnik wzrostu (FGF-2), natomiast wektor pSDF-1 – białko SDF-1. Wektory pVIF i pSDF-1 podane śródskórnie myszom w formie kompleksów z nośnikiem PEI stymulują angiogenezę najprawdopodobniej na zasadzie odmiennych procesów. Główny mechanizm proangiogennej aktywności VEGF sprowadza się do stymulacji swoistych receptorów (głównie VEGFR1 i VEGFR2) na komórkach śródbłonkowych, natomiast SDF-1 jest chemokiną przede wszystkim oddziałującą na śródbłonkowe komórki progenitorowe [7, 8, 15]. W niniejszej pracy preparaty proangiogennych wektorów – plazmidowego DNA i nośnika polietylenoiminy – próbowano wykorzystać do indukcji neowaskularyzacji w skórze, jak również do stymulacji wzrostu włosów. Dane eksperymentalne wykazują, że właściwe ukrwienie skóry może być decydujące dla prawidłowego wzrostu włosów [16–18]. W pracy wzrost włosów stymulowano przez indukcję angiogenezy za pomocą preparatów genowych. Stosowano preparaty o jakości farmakopealnej. Niektóre z zastosowanych, np. wektory pVEGF165 i pVIF, są dopuszczone do prób klinicznych terapii genowej chorób naczyniowo-sercowych w Polsce [11, 12]. Z obserwacji wzrostu włosów u myszy, którym podano śródskórnie plazmidy proangiogenne (kompleksy pDNA:PEI, R=5) wynika, że preparaty genowe silnie stymulujące skórną angiogenezę pobudzają również wzrost włosów. Efekt obserwowano po ok. 14–18 dniach od iniekcji. Jak przedstawiono na ryc. 6. najsilniej wzrost włosów pobudza bicistronowy wektor pVIF. Wyniki wskazują, że silna, lokalna ekspresja cytokin VEGF i FGF wzmaga angiogenezę i wzrost włosów. Metodą PCR (ryc. 7.) potwierdzono obecność sekwencji plazmidowych w miejscach silnej angiogenezy i intensywnego wzrostu włosów.
Wnioski
W pracy analizowano trzy geny proangiogenne – Vegf, Fgf oraz Sdf, które w formie wektorów plazmidowych kompleksowano z polietylenoiminą 25 kDa i wprowadzano śródskórnie do zwierząt laboratoryjnych. Poszukiwano kompleksów najefektywniej wprowadzających geny proangiogenne do komórek skóry i stymulujących tym samym skórną angiogenezę. W wyniku badań stwierdzono, że do najsilniejszych induktorów neowaskularyzacji zalicza się wektory pVIF i pSDF w postaci kompleksów pDNA:PEI o współczynniku kompleksowania R=5. Jak pokazują wyniki badań (tab. 1., ryc. 1.–5., 7.) wykorzystane preparaty efektywnie stymulują neoangiogenezę w skórze zwierząt laboratoryjnych. Stwierdzono, że po śródskórnej iniekcji preparatów dochodzi do tworzenia kapilar oraz obserwuje się również silny wzrost włosów (ryc. 6.). Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń wykazano, że z wykorzystanych preparatów genowych proangiogennych wzrost włosów najsilniej pobudza preparat bicistronowego wektora pVIF (kompleks pDNA:PEI, R=5).
Piśmiennictwo
1. www.wiley.com. 2. Rosa DD, Ismael G, Lago LD, Awada A. Molecular-targeted therapies: lessons from years of clinical development. Cancer Treat Rev 2008; 34: 61-80. 3. Kawakami S, Higuchi Y, Hashida M. Nonviral approaches for targeted delivery of plasmid DNA and oligonucleotide. J Pharm Sci 2008; 97: 726-45. 4. Lungwitz U, Breunig M, Blunk T, Göpferich A. Polyethylenimine-based non-viral delivery systems. Eur J Pharm Biopharm 2005; 60: 247-66. 5. Boussif O, Lezoualc'h F, Zanta MA, et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A 1995; 2: 7297-301. 6. Folkman J, Shing Y. Angiogenesis. J Biol Chem 1992; 267: 10931-4. 7. Ferrara N, Garber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med 2003; 6: 669-76. 8. Rumpold H, Wolf D, Koeck R, Gunsilius E. Endothelial progenitor cells: a source for therapeutic vasculogenesis? J Cell Mol Med 2004; 8: 509-18. 9. Ylä-Herttuala S, Alitalo K. Gene transfer as a tool to induce therapeutic vascular growth. Nat Med 2003; 9: 694-9. 10. Malecki M, Kolsut P, Proczka R. Angiogenic and antiangiogenic gene therapy. Gene Ther 2005; 12 (Suppl 1): S159-69. 11. Kołsut P, Malecki M, Zelazny P, et al. Gene therapy of coronary artery disease with phvegf165 – early autcome. Kardiol Pol 2003; 59: 373-84. 12. Kukuła K, Dąbrowski M, Chojnowska L i wsp. Podstawy teoretyczne i plan badania VIFCAD – terapii genowej choroby wieńcowej u pacjentów bez możliwości zabiegowej rewaskularyzacji z zastosowaniem podawanego trans-endokardialnie plazmidu bicistronowego VEGF/FGF. Post Kardiol Interw 2006; 2: 116-23. 13. Paller AS. Genetic disorders of skin: a decade of progress. Arch Dermatol 2003; 139: 74-7. 14. Sidky YA, Auerbach R. Lymphocyte-induced angiogenesis: a quantitative and sensitive assay of the graft-vs-host reaction. J Exp Med 1975; 141: 1084-100. 15. Petit I, Jin D, Rafii S. The SDF-1-CXCR4 signaling pathway: a molecular hub modulating neo-angiogenesis. Trends Immunol 2007; 28: 299-307. 16. Detmar M. The role of VEGF and thrombospondins in skin angiogenesis. J Dermatol Sci 2000; 24 (Suppl 1): S78-84. 17. Chang E, Yang J, Nagavarapu U, Herron GS. Aging and survival of cutaneous microvasculature. J Invest Dermatol 2002; 118: 752-8. 18. Fujihara Y, Koyama H, Ohba M, et al. Controlled delivery of bFGF to recipient bed enhances the vascularization and viability of an ischemic skin flap. Wound Repair Regen 2008; 16: 125-31.