Original paper
Influence of selected peptides and their copper complexes on antioxidant enzyme activities in human skin fibroblasts

Wprowadzenie
Istnieje wiele zabiegów, które stosuje się w celu zahamowania starzenia się skóry. Jedną z najbardziej popularnych i nieinwazyjnych metod jest miejscowe stosowanie kosmetyków. Kosmetyki, które mają za zadanie hamować efekt starzenia się skóry, zwane są popularnie anti-aging lub anti-wrinkle cosmetics. Zawierają one wiele związków zarówno pochodzenia roślinnego (np. fitoestrogeny, resweratrol, piknogenol, ekstrakty z miłorzębu japońskiego, wąkroty azjatyckiej), jak i chemicznego (retinoidy, palmitynian askorbylu, octan tokoferylu). Każda z metod ma wady i ograniczenia. Kwas retinowy wolno remodeluje tkankę skórną, ale kosztem przewlekłego podrażnienia i zaczerwienienia. Melatonina czy witamina C zwiększają syntezę kolagenu. Zwiększona ilość kolagenu w obrębie skóry nie jest jednak wystarczająca. Na pewnym etapie przebudowy skóry potrzebna jest aktywacja angiogenezy, zwiększona synteza elastyny, proteoglikanów i glikozaminoglikanów [1, 2]. Nawet kontrolowane procesy uszkodzenia skóry, takie jak peeling, dermabrazja czy techniki laserowe, są skuteczne tylko wtedy, gdy tkanka skórna jest w stanie prawidłowo zregenerować się po zakończonej terapii.
Wciąż poszukuje się nowych związków, które mogłyby wpływać na przebudowę skóry i jednocześnie zwiększać jej zdolność do regeneracji. Ostatnio dużo uwagi poświę-ca się biologicznie aktywnym peptydom, a szczególnie ich połączeniom z jonami miedzi (Cu2+) CPs (copper peptides) [3]. Niskocząsteczkowe peptydy, w zależności od pełnionych funkcji, można podzielić na trzy podstawowe grupy: peptydy sygnałowe (heksapeptyd Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly, lipidopentapeptyd Palmitoilo-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser SYN®-COLL), peptydowe inhibitory neurotransmiterów (toksyna botulinowa, Argirelina®, acetyloglutamyloheksapeptyd-1, Leuphasyl®, SYN-AKE®) oraz peptydy transportujące [1, 4, 5]. Peptydy transportujące ze względu na budowę strukturalną i przestrzenną są zdolne do wiązania innych substancji, zwiększając ich rozpuszczalność, trwałość czy biodostępność. Najczęściej są to di-, tri- i tetrapeptydy dobrze rozpuszczalne w wodzie (np. Gly-His-Lys, Gly-His-Lys-His, Gly-Gly-His, Gly-Gly-Gly, Ala-Gly-His). Peptydy transportują głównie jony metali (Zn2+, Cu2+, Ni2+, Mn2+). Do najbardziej znanych peptydów transportujących jony Cu2+ należy tripeptyd Gly-His-Lys (GHK) oraz Gly-Gly-His (GGH) [6]. Kompleks GHK-Cu w stężeniach, rzędu 10–10 M, stymuluje aktywność fibroblastów, przyspiesza biosyntezę kolagenu, elastyny, glikozoaminoglikanów, siarczanu chondroityny i siarczanu dermatanu. Zwiększa aktyw- ność metaloproteinaz macierzy pozakomórkowej, takich jak MMP-2 i MMP-9, oraz tkankowych inhibitorów meta- loproteinaz TIMP-1 i TIMP-2 [7]. Wpływ GHK-Cu na przebudowę macierzy pozakomórkowej oraz procesy angiogenezy, szczególnie w obrębie tkanki skórnej, wykorzystano w leczeniu trudno gojących się ran u zwierząt [8]. Efektem związania jonów Cu2+ przez GHK jest zahamowanie procesów autooksydacyjnych. Dotyczy to zarówno miedziozależnego utleniania niskocząsteczkowych lipoprotein LDL [9], jak i hamowania procesów oksydacyjnych, np. peroksydacji lipidów w uszkodzonych tkankach, katalizowanych przez dwuwartościowe jony żelaza (Fe2+) [10]. W obrębie cytoplazmy lub mitochondrium Cu2+ ulegają redukcji do Cu+. W normalnych warunkach w komórce wolne, tj. niezwiązane, jony Cu+ nie występują, ponieważ są szybko wychwytywane przez zredukowaną formę glutationu GSH i w takiej formie przekazywane do metalotioneiny. Pojawienie się wolnych Cu2+ może prowadzić do stresu oksydacyjnego. Jony Cu+ – podobnie jak Fe2+ – w reakcji Fentona mogą ulec procesowi utleniania. Miedź wchodzi jednak w skład wielu metaloenzymów, bierze udział w biosyntezie kolagenu, elastyny i glikozoaminoglikanów, w procesie gojenia się ran, wchłanianiu i transporcie żelaza, metabolizmie kwasów tłuszczowych, syntezie RNA oraz melanogenezie [11, 12].


Cel
Celem pracy była ocena wpływu tripeptydów GGH i GHK oraz ich kompleksów z miedzią na proces proliferacji i aktywność enzymów antyoksydacyjnych, tj. dysmutazy ponadtlenkowej, peroksydazy i reduktazy glutationowej, w ludzkich prawidłowych fibroblastach skóry.


Materiał i metody
Materiał użyty do badań oraz stosowane odczynniki
Materiałem użytym do badań były prawidłowe ludzkie fibroblasty skóry linii NHDF (Normal Human Dermal Fibroblast). Hodowle prowadzono w inkubatorze firmy Nuaire (model NU480E), w temperaturze 37°C, w atmo-sferze składającej się w 95% z powietrza i 5% z dwutlenku węgla, przy wilgotności wynoszącej 95%. Komórki hodowano w naczyniach polistyrenowych o powierzchni 25 cm² (Nunc EasY Flask) zaopatrzonych w filtry bakteriologiczne. Komórki pasażowano co 10 dni z zastosowaniem roztworu zawierającego 0,25% trypsyny z dodatkiem 1 mM EDTA • 4 Na (Life Technologies). Fibroblasty hodowano w zbuforowanym medium hodowlanym (MEM, Sigma) zawierającym 10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS, Gibco) oraz 100 U/ml penicyliny (Sigma) i 100 µg streptomycyny (Sigma). Do badań użyto: 100-milimolowego wodnego roztworu tripeptydu Gly-Gly-His (Sigma), 100-milimolowego wodnego roztworu dwuwodnego chlorku miedzi (II) CuCl2 × 2 H₂O (Sigma), 25-milimolowego roztworu soli octanowej tripeptydu Gly-His-Lys (Sigma) oraz produktu fermentacji białek drożdży Saccharomyces cerevisiae hodowanych na pożywce wzbogaconej o miedź Oligolides Copper® [INCI, Water (and) Saccharomy-ces/Copper Ferment (and) Phenoxyethanol (and) Methylparaben (and) Butylparaben (and) Ethylparaben (and) Propylparaben (and) Isobutylparaben, Creations Couleurs]. Preparat Oligolides Copper® do badań udostępniła firma PPH Ryszard Kaczmarek i Synowie sp. z o.o.


Warunki prowadzenia hodowli eksperymentalnej oraz przygotowanie materiału do badań
Hodowlę eksperymentalną inicjowano poprzez wprowadzenie 105 komórek NHDF, zawieszonych w 12 ml medium, do szalek o powierzchni 56 cm² (Nunclon TMD Dishes). Następnie dodawano medium zawierające testowane peptydy i ich kompleksy miedziowe (1 nM GGH, 1 nM GGH-Cu, 1 nM GHK, 1 nM GHK-Cu, 1 nM CuCl2). Komórki w obecności badanych związków hodowano przez 4 doby bez zmiany pożywki na świeżą, później płukano 2-krotnie RPMI-1640 (4°C) i zdrapywano, a otrzymaną zawiesinę wirowano przez 5 min przy 13 tys. obrotów na minutę (4°C). Komórki sonifikowano w buforze fosforanowym za pomocą homogenizatora ultra-dźwiękowego (Bandelin Elektronic UW2070) przez 30 s (3 cykle, 70% mocy, 4°C). Powstały homogenat wirowano przez 10 min przy 15 tys. obrotów na minutę (4°C).


Ocena proliferacji i aktywności metabolicznej komórek NHDF
W celu określenia wpływu badanych związków na proces proliferacji fibroblastów wykorzystano komercyjnie dostępny test In Vitro Toxicology Assay Kit XTT Based TOX-2 (Sigma), którego głównym składnikiem jest sól sodowa 2,3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo]-2H-tetra-zolinum-5-karboksyanilidu (XTT). Badanie wykonano w 96-dołkowej mikropłytce (Corning Incorporated Costar®). Do każdej studzienki wprowadzano po 5 tys. komórek w 200 µl pożywki, a następnie po 24 godz. medium hodowlane zawierające badane związki. Tak przygotowaną mikropłytkę inkubowano przez 72 godz. w standardowych warunkach ciśnienia i temperatury. Intensywność powstałego zabarwienia mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali l = 450 nm, stosując czytnik mikropłytek TRIAD LT (Dynex Technologies).


Ocena aktywności enzymów antyoksydacyjnych
Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) oraz peroksydazy i reduktazy glutationowej (GPx i GR) oznaczono za pomocą komercyjnie dostępnych testów firmy Randox Laboratories. Badano poziom absorbancji (dla SOD przy l = 505 nm, dla GPx przy l = 340 nm, dla GR przy l = 340 nm). Pomiarów dokonano w odstępach 30-sekundowych przez 3 min w temperaturze 37°C. Jako jednostkę aktywności SOD przyjęto taką ilość enzymu, która powoduje 50-procentowe zahamowanie szybkości reakcji powstawania formazanu. Jako jednostkę aktywności GPx przyjęto taką ilość enzymu, która w ciągu 1 min utlenia 1 µM GSH (0,5 µM NADPH). Jako jednostkę aktywności GR przyjęto taką ilość enzymu, która w ciągu 1 min utlenia 1 nM NADPH. Aktywność enzymów antyoksydacyjnych przeliczono na zawartość białka w badanym homogenacie. Stężenie białka oznaczano metodą Bradforda.


Analiza statystyczna
Wartości na rycinach są średnimi arytmetycznymi (x) z pomiarów wykonanych na materiale pochodzącym z trzech, tak samo traktowanych, hodowli. Miarą rozproszenia było odchylenie standardowe (SD). Analizę statystyczną otrzymanych wyników przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA, wykorzystując program komputerowy STATISTICA 6.0. W obliczeniach przyjęto poziom istotności p < 0,05. Grupy homogenne na poziomie 95% przedziału ufności wyróżniono metodą opartą na najmniejszych istotnych różnicach (test post-hoc Tukeya). Podstawą do przyjęcia założenia o jednorodności wariancji było zastosowanie testu Levena.


Wyniki


Ocena wpływu peptydów oraz ich kompleksów z miedzią na proliferację ludzkich fibroblastów skóry
Pierwszym etapem badań była ocena wpływu 1-nanomolowego i 100-nanomolowego roztworu CuCl2, GGH, GGH-Cu, GHK, GHK-Cu oraz 3-procentowego roztworu Oligolides Copper® na proliferację ludzkich fibroblastów skóry linii NHDF. Kontrolę dla różnych stężeń tripeptydów GGH i GHK stanowiły komórki hodowane w pożywce niezawierającej badanych związków. Tripeptyd GGH w zastosowanych stężeniach 1 nM (p = 0,003) i 100 nM (p = 0,007) istotnie zwiększał proces proliferacji fibroblastów. Podobny efekt zauważono w przypadku 1-nanomolowego (p = 0,0002) i 100-nanomolowego (p = 0,0001) tripeptydu GHK oraz 3-procentowego preparatu Oligolides Copper® (p = 0,04). Trzyprocentowy roztwór Oligolides Copper® zwiększał proces proliferacji badanych komórek względem 1-nanomolowego i 100-nanomolowego roztworu CuCl2 (odpowiednio p = 0,0003 i p = 0,003). Wydaje się, że miedź w zastosowanych stężeniach nie wpływa na proces proliferacji komórek. Dodatek peptydów wpływa na proliferację. Niewielka różnica między średnią liczbą komórek w kontroli a komórek narażonych na badane związki może być spowodowana bardzo wolnym zwiększeniem się liczby badanych komórek. Zbadano również wpływ dodatku CuCl2 do roztworów GGH i GHK. Kompleks GGH-Cu zwiększa proces proliferacji (dla 1-nanomolowego GGH-Cu p = 0,001, dla 100-nanomolowego GGH-Cu p = 0,0002). Aktywność proliferacyjna komórek hodowanych w obecności GGH i GGH-Cu nie różni się, dlatego dodatek miedzi do roztworów GGH nie wpływa na proces proliferacji. W przypadku tripeptydu GHK zaobserwowano wręcz zmniejszenie proliferacji po dodaniu Cu2+ (ryc. 1.–3.).


Ocena wpływu peptydów oraz ich kompleksów z miedzią na aktywność enzymów SOD, GPx i GR w fibroblastach skóry
W fibroblastach skóry inkubowanych 4 doby w obecności 1-nanomolowego roztworu peptydów GGH i GHK oraz ich kompleksów z miedzią GGH-Cu i GHK-Cu nie zaobserwowano wzrostu aktywności SOD. W przeciwień-stwie do peptydów prawie 2-krotny wzrost aktywności odnotowano po zastosowaniu CuCl2. Wydaje się, że dodatek peptydów nie wpływa na aktywność SOD, a ich zdolność do kompleksowania Cu2+ może przyczyniać się wręcz do zmniejszenia tej aktywności (ryc. 4.). Z przedstawionych badań wynika, że 1-nanomolowe roztwory peptydów, ich kompleksów z miedzią oraz samej miedzi zmniejszają aktywność GPx (ryc. 5.). W przeciwień-stwie do GPx, nie zaobserwowano wpływu 1-nanomolowych roztworów peptydów, ich kompleksów z miedzią oraz miedzi na aktywność GR (p < 0,05, ANOVA) (ryc. 6.).


Omówienie wyników
Reaktywne formy tlenu (RFT) w komórkach są naturalnymi produktami metabolizmu tlenowego i w stę-żeniach fizjologicznych pełnią ważne funkcje regula- cyjne, m.in. przekazują sygnały wewnątrzkomórkowe i międzykomórkowe [13]. Do najczęściej spotykanych RFT należą: anionorodnik ponadtlenkowy (O2• –), tlen singletowy (1O2), nadtlenek wodoru (H₂O2), rodnik hydroksylowy (OH•), rodnik wodoronadtlenkowy (HO2•), tlenek azotu (NO) oraz ozon (O3). Zaburzenie fizjologicznej równowagi między wytwarzaniem RFT a ich „zmiataniem” przez enzymy antyoksydacyjne prowadzi do stresu oksydacyjnego. Szczególnie dużo RFT powstaje w komórkach skóry, która jest narażona na działanie wielu czynników środowiskowych, m.in. promieniowanie ultrafioletowe. Znajdujące się w komórkach witaminy A, C, E, Zn, Se, -karoten, flawonoidy, enzymy antyksydacyjne, takie jak: SOD, katalaza glutationowa, GPx i GR, chronią nas przed szkodliwym działaniem RTF. Dysmutaza ponadtlenkowa należąca do oksydoreduktaz katalizuje reakcję dysmutacji O2•– do H₂O2 i O2 [14]. Jest ona najważniejszym enzymem antyoksydacyjnym skóry. Analizując wpływ 1-nanomolowych roztworów wodnych peptydów Gly-Gly-His (GGH) czy Gly-His-Lys (GHK) oraz ich kompleksów z miedzią GHK-Cu i GGH-Cu na aktywność SOD w ludzkich fibroblastach skóry linii NHDF, nie zaobserwowano wzrostu aktywności SOD. W przeciwieństwie do peptydów, prawie 2-krotne zwiększenie aktywności zaobserwowano po zastosowaniu 1-nanomolowego roztworu CuCl2. Miedź jest mikroelementem niezbędnym dla prawidłowego przebiegu procesów fizjologicznych [15]. Niedobór miedzi u szczurów może prowadzić do zmniejszenia aktywności SOD w tkankach, czego efektem jest zwiększona liczba produktów peroksydacji lipidów w obrębie serca, wątroby i trzustki, np. malonylodialdehydu MDA [16, 17]. Badając stabilność SOD, wykazano, że jony Cu2+ zwiększają odporność termiczną tego białka znacznie silniej niż Zn2+ [18]. Warto zauważyć, że nadmiar miedzi w diecie jest niewskazany ze względu na jej właściwości prooksydacyjne [19].
Wpływ miedzi na procesy oksydoredukcyjne skóry wykorzystano w przemyśle kosmetycznym. Wodne roztwory CuCl2 czy CuSO4, dodawane do kremów czy emulsji, charakteryzują się małą biodostępnością, w związku z tym również małą skutecznością. Wiąże się to przede wszystkim z wielkością cząsteczki, właściwościami fizykochemicznymi, które utrudniają przenikanie przez barierę białkowo-lipidową, jaką jest skóra. Poprawę biodostępności Cu2+ realizuje się poprzez wiązanie ich ze specyficznym nośnikiem. Do takich nośników zalicza się przede wszystkim peptydy, takie jak GHK czy GGH, które tworzą trwałe kompleksy z miedzią. Kompleks GHK-Cu w warunkach in vitro ma zdolność przenikania przez warstwę rogową zarówno z roztworów wodnych, jak i emulsji O/W, co warunkuje jego aktywność biologiczną. Tripeptyd GHK-Cu stanowi więc efektywny transporter dla Cu2+, znacznie zwię- kszając szybkość ich penetracji przez warstwę rogową naskórka [20]. Do GHK przyłącza się również hydrofobowe ugrupowanie R, którym najczęściej są kwasy tłuszczowe, m.in. heksanowy (hexa-GHK), dekanowy (deca-GHK) czy mirystynowy (myr-GHK). Dobrym rozwiązaniem jest także aplikacja związków miedzi w postaci liposomów [21]. Oprócz kwasów tłuszczowych, do cząsteczki GHK można przyłączyć biotynę. Taki biotynylowany GHK inkorporowany do matrycy kolagenowej zwiększał w obrębie gojącej się rany ponad 9-krotnie stężenie Cu2+, zwiększał aktywność Cu/Zn-SOD, stężenie glutationu, kwasu askorbinowego oraz proliferację fibroblastów i mastocytów [22, 23].
Wyniki badań przeprowadzonych w ramach niniejszej pracy wykazały, że za pobudzenie aktywności SOD są odpowiedzialne nieskompleksowane jony Cu2+. Zastosowane w warunkach in vitro peptydy zmniejszają wolną pulę tych jonów, przez co zmniejszają aktywność SOD. W warunkach in vivo w skórze znajduje się wiele peptydaz, które rozkładają peptydy transportujące, zwię-kszając przy tym stężenie Cu2+. Peptydy odgrywają ważną rolę nośnikową, ale po przedostaniu się do miejsca działania mogą także zmniejszać dostępność Cu2+. Dysmutaza ponadtlenkowa chroni ludzkie keratynocyty skóry przed uszkodzeniami indukowanymi przewlekłą ekspozycją na promieniowanie ultrafioletowe typu B [24]. Z tego względu wydaje się celowe wprowadzanie do preparatów fotoochronnych, obok filtrów przeciwsłonecznych, także związków stymulujących aktywność SOD [25].
Peptydy GGH czy GHK, oprócz roli transportującej, wpływają również na procesy przebudowy tkanki skórnej. Według Pickarta [6] proliferacja i proces różnicowania się komórek macierzystych skóry zależy od stężenia Cu2+. Małe stężenia stymulują proliferację komórek, jednocześnie hamując ich różnicowanie. Tripeptyd GHK zwię-kszał proliferację komórek macierzystych, w przeciwień-stwie do kompleksu GHK-Cu, który z kolei nasilał ich różnicowanie. Stymulacja proliferacji fibroblastów w przypadku tripeptydu GHK obserwuje się już przy stężeniu 10–12 M [6]. W przeprowadzonych badaniach wykazano, że zarówno tripeptyd GHK, jak i GGH w stężeniu 10–7 i 10–9 M stymulują proces proliferacji ludzkich fibroblastów skóry linii NHDF, odpowiedzialnych za syntezę składowych macierzy pozakomórkowej m.in. kolagenu. Stwierdzono również, że dodatek miedzi do GGH nie wpływa na proces proliferacji. Wydaje się, że za zwiększenie proliferacji fibroblastów jest odpowiedzialna frakcja peptydowa, a nie dodatek Cu2+. Skórna aplikacja GHK-Cu w postaci kremu silniej stymuluje fibroblasty do pro- dukcji kolagenu niż kwas retinowy czy witamina C, a ponadto nie wykazuje właściwości drażniących [26]. Kosmetyki dostępne na polskim rynku nie zawierają aktywnej miedzi w postaci kompleksów GGH-Cu czy GHK-Cu. Jony miedzi występują jedynie w postaci komercyjnie dostępnych hydrolizatów białkowych, np. Oligolides Copper®, które są produktem fermentacji białek drożdży Saccharomyces cerevisiae hodowanych na pożywce wzbogaconej o związki miedzi. Zastosowanie preparatu Oligolides Copper® w stężeniu 3% – podobnie jak GHK czy GGH – zwiększało proliferację ludzkich fibroblastów skóry.
Oprócz aktywności SOD, zbadano wpływ 1-nanomolowych roztworów GGH i GHK oraz ich kompleksów z miedzią (GGH-Cu i GHK-Cu) na aktywność GPx i GR. Peroksydaza glutationowa katalizuje reakcję między glutationem (GSH) a H₂O2: 2 GSH + H₂O2 ® GSSG + 2 H₂O. Powstający w wyniku tej reakcji GSSG jest redukowany przez GR [13, 14]. W pracy wykazano, że 1-nanomolowe stężenia badanych związków nie wpływają na aktywność GR, natomiast zaobserwowano wyraźne zmniejszenie aktywności GPx. Niedobór miedzi zmniejsza aktywność nie tylko SOD, ale również katalazy i GPx [16]. Długo-trwała ekspozycja na Cu2+ prowadzi do zwiększenia aktywności GPx oraz Mn-SOD, natomiast nie wpływa na aktywność katalazy glutationowej i GR [27]. Komórki raka wątroby linii HAC600, które charakteryzują się gromadzeniem w obrębie cytoplazmy związków miedzi i dużym stężeniem metalotioneiny, wykazują dużą aktywność GPx [28]. Z badań Geetha i wsp. [29] wynika, że zwiększenie osoczowego stężenia wolnej, niezwiązanej z ceruloprazminą, miedzi zwiększa peroksydację lipidów w komórkach raka wątrobowokomórkowego, a z kolei zwiększenie markerów stresu oksydacyjnego prowadzi do obniżenia w tkance wątrobowej aktywności GPx, SOD czy katalazy. Prawdopodobnie zwiększenie aktywności SOD może być odpowiedzialne za zmniejszenie aktywności GPx. Wydaje się, że wpływ miedzi na aktywność enzymów antyoksydacyjnych jest tkankowo specyficzna. Miedź jest jednym z wielu elementów skomplikowanej sieci mechanizmów, które regulują procesy prooksydacyjne i antyoksydacyjne w komórkach.


Piśmiennictwo  
1. Choi CM, Berson DS. Cosmeceuticals. Semin Cutan Med Surg 2006; 25: 163-8.  
2. Sikora M. Pentapeptydy w recepturach kosmetycznych. Kosmet Kosmetol 2007; 3: 30-3.
3. Pickart L. Copperceuticals and the skin. Cosmet Toiletr 2003; 24-8.  
4. Stepulak M. Kosmetyki oparte na peptydach – czyżby nowy sposób na walkę z efektami starzenia. Rynek Kosmetyków i Farmaceutyków 2007; 01, e-czasopismo.  
5. Deprez P. Oligopeptydy naśladujące działanie toksyny botulinowej (I). Med Estet Anti-Aging 2007; 2: 18-25.  
6. Pickart L. The human tri-peptide GHK and tissue remodeling. J Biomater Sci Polym Ed 2008; 19: 969-88.
7. Maquart FX, Pickart L, Laurent M, et al. Stimulation of collagen synthesis in fibroblast cultures by the tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+. FEBS Lett 1988; 238: 343-6.  
8. Maquart FX, Siméon A, Pasco S, Monboisse JC. Regulation of cell activity by the extracellular matrix: the concept of matrikines. J Soc Biol 1999; 193: 423-8.  
9. Thomas CE. The influence of medium components on Cu2+-dependent oxidation of low-density lipoproteins and its sensitivity to superoxide dismutase. Biochim Biophys Acta 1992; 1128: 50-7. 10. Artc J. Preparaty miedziowe w kosmetyce pielęgnacyjnej skóry. Derm Estet 2003; 2: 87-90.
11. Kleszczewska E, Jabłońska-Trypuć A. Aktywność biologiczna miedzi i cynku oraz ich znaczenie w metabolizmie skóry. Med Estet Ant-Aging 2007; 3: 11-21.
12. Mucha A, Cappanelli M, Szczepanik W, et al. Influence of the physiologically widespread substances on the oxidative activity of copper(II) complexes with sinefungin, a nucleoside antibiotic. J Inorg Biochem 2006; 100: 178-85.
13. Gałecka E, Jacewicz R, Mrowicka M i wsp. Enzymy antyoksydacyjne – budowa, właściwości, funkcje. Pol Merk Lek 2008; 147: 266-8.
14. Radwańska-Wala B, Buszman E, Drużba D. Udział reaktywnych form tlenu w patogenezie chorób ośrodkowego układu nerwowego. Wiad Lek 2008; 1: 67-73.
15. Frydrych A, Arct J, Kasiura K. Przeznaskórkowy transport me-tali – korzyści i zagrożenia. Wiad Pol Tow Kosm 2005; 1: 14-8.
16. Bureau I, Gueux E, Mazur A, et al. Female rats are protected against oxidative stress during copper deficiency. J Am Coll Nutr 2003; 22: 239-46.
17. Bertinato J, Iskandar M, L’Abbé MR. Copper deficiency induces the upregulation of the copper chaperone for Cu/Zn superoxide dismutase in weanling male rats. J Nutr 2003; 133: 28-31.
18. Lynch SM, Colón W. Dominant role of copper in the kinetic stability of Cu/Zn superoxide dismutase. Biochem Biophys Res Commun 2006; 340: 457-61.
19. Roughead ZK, Johnson LK, Hunt JR. Dietary copper primarily affects antioxidant capacity and dietary iron mainly affects iron status in a surface response study of female rats fed varying concentrations of iron, zinc and copper. J Nutr 1999; 129: 1368-76.
20. Mazurowska L, Mojski M. Biological activities of selected peptides: skin penetration ability of copper complexes with peptides. J Cosmet Sci 2008; 59: 59-69.
21. Almińana N, Alsina MA, Reig F. New GHK hydrophobic derivatives: interaction with phospholipid bilayers. Colloids Surf B Biointerfaces 2007; 57: 243-9.
22. Arul V, Gopinath D, Gomathi K, et al. Biotinylated GHK peptide incorporated collagenous matrix: a novel biomaterial for dermal wound healing in rats. J Biomed Mater Res B Appl Biomater 2005; 73: 383-91.
23. Arul V, Kartha R, Jayakumar RA. A therapeutic approach for diabetic wound healing using biotinylated GHK incorporated collagen matrices. Life Sci 2007; 80: 275-84.
24. Sander CS, Chang H, Salzmann S, et al. Photoaging is associated with protein oxidation in human skin in vivo. J Invest Dermatol 2002; 118: 618-25.
25. Pickart L. Skin remodeling copper peptides. Cosmet Med 2004; 2: 14-29.
26. Pickart L. Copper peptides for tissue regeneration. Spec Chem 2002; 9: 29-31.
27. Brouwer M, Brouwer TH. Biochemical defense mechanisms against copper-induced oxidative damage in the blue crab, Callinectes sapidus. Arch Biochem Biophys 1998; 351: 257-64.
28. Freedman JH, Ciriolo MR, Peisach J. The role of glutathione in copper metabolism and toxicity. J Biol Chem 1989; 264: 5598-605.
29. Geetha A, Saranya P, Annie Jeyachristy S, et al. Relevance of non-ceruloplasmin copper to oxidative stress in patients with hepatocellular carcinoma. Biol Trace Elem Res 2009 (artykuł przyjęty do druku).