Original paper
T regulatory CD4+CD25high lymphocytes in peripheral blood of patients suffering from psoriasis

Wprowadzenie
Łuszczyca (psoriasis vulgaris) jest przewlekłą, zapalną chorobą skóry uwarunkowaną genetycznie, występującą w populacji z różną częstością 0,2–4,8% [1]. Od kilku lat łuszczycę plackowatą uważa się za chorobę skóry o podłożu immunologicznym, mediowaną przez limfocyty T, przebiegającą z nadmierną proliferacją i nieprawidłowym różnicowaniem komórek naskórka [2, 3]. Charakterystyczna dla tej jednostki jest przewaga odpowiedzi komórkowej, związanej z limfocytami T CD4+ (Th1), z towarzyszącą produkcją cytokin prozapalnych, głównie interleukiny 2 (IL-2), czynnika martwicy nowotworów (tumour necrosis factor a – TNF-a), interferonu g (IFN-g), interleukiny 12 (IL-12) i 23 (IL-23). W badaniach immunohistochemicznych wykazano, że w wykwitach łuszczycowych znajdują się głównie limfocyty T-pomocnicze CD4+ (Th), cytotoksyczne CD8+ (Tc), NK, NK-T oraz regulatorowe CD4+, CD25+. Interleukina 1, 6 i 23 odpowiadają za różnicowanie się limfocytów T-pomocniczych (Th), produkujących IL-17 (Th17). Pobudzone limfocyty Th17 wydzielają IL-17A, IL-17F, IL-6, TNF-a oraz IL-22. Profil tych cytokin różni się od wydzielanych przez limfocyty Th1 i Th2. Limfocyty Th17 i IL-17 wywołują hiperproliferację keratynocytów, promują stan zapalny poprzez stymulację migracji neutrofili do naskórka i indukcję cytokin prozapalnych. Uważa się, że komórki te są wyspecjalizowane w zwalczaniu bakterii zewnątrzkomórkowych i niektórych grzybów. Aktywacja limfocytów T i sekrecja czynników prozapalnych powodują wzmożoną angiogenezę, infiltrację leukocytów i powstawanie mikroropni Munro w warstwie rogowej skóry. Do cech charakterystycznych dla łuszczycy należą: niska ekspresja markerów różnicowania keratynocytów (keratyny K1 i K10), zanik warstwy ziarnistej, parakeratoza oraz wydłużenie sopli naskórkowych. Keratynocyty wytwarzają czynniki stymulujące angiogenezę, powodując nadmierną proliferację naczyń skóry. Zarówno w blaszkach łuszczycowych, jak i w surowicy chorych stwierdzono podwyższony poziom czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (vascular endothelial growth factor – VEGF). Leukocyty obecne w wykwitach łuszczycowych to przede wszystkim limfocyty o fenotypie Th1 CD4+ znaj-dujące się w skórze właściwej i CD8+ w naskórku. Komórki te mają na powierzchni cząsteczki LFA-1 (lymphocyte-1 function-associated antygen – CD11/CD18), receptor zasiedlania skóry CLA (cutaneous lymphocyte antygen), bardzo późny antygen VLA-4 (very late antigen – CD49c), cząsteczki ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1 – CD54), VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1 – CD106) i integrynę aE(CD103)b7, które promują przyleganie i migrację limfocytów. Na keratynocytach znajdują się ICAM-1, E-kadheryny, natomiast na śródbłonku naczyń skórnych występuje E-selektyna. Cząsteczki te umożliwiają przyleganie leukocytów. Obie subpopulacje limfocytów T CD4+ i CD8+ wykazują ponadto ekspresję HLA-DR i receptora dla IL-2 (CD25), będących markerami stanu pobudzenia. Większość limfocytów T stanowią efektorowe komórki pamięci, mające antygeny CD45RO+. W wykwitach łuszczycowych znajdują się głównie limfocyty Tc1, a ich znaczenie nie jest do końca znane. Stopień zaawansowania klinicznego koreluje z liczbą krążących limfocytów CD8+. Limfocyty te rozpoznają antygen HLACw6*602 związany z łuszczycą typu I, prezentujący sekwencje aminokwasowe obecne w białkach M paciorkowców i keratynach typu I [4]. Ostatnio zwrócono uwagę na limfocyty T-regulatorowe (Treg) CD4+CD25+, które u chorych na łuszczycę wykazują defekt funkcjonalny polegający na obniżonej zdolności do supresji limfocytów efektorowych Th1 [1] oraz ich rolę w patogenezie łuszczycy [5, 6].


Cel
Celem pracy była cytometryczna ocena odsetka limfocytów Treg CD4+CD25high we krwi obwodowej chorych na łuszczycę w różnych stadiach nasilenia choroby.


Materiał i metody
Badaniem objęto populację 50 chorych na łuszczycę zwyczajną, bez współistniejących schorzeń ogólnoustrojowych i dolegliwości bólowych stawów, leczonych na Oddziale Dermatologii ZOZ MSWiA w Poznaniu im. prof. Ludwika Bierkowskiego z powodu nawrotu zmian skórnych w latach 2004–2008. Analizowani pacjenci przez 2 mies. nie stosowali terapii miejscowych bądź układowych modyfikujących przebieg łuszczycy. Stan dermatologiczny oceniano za pomocą skali Psoriasis Area and Severity Index (PASI). Przyjęto kryteria zaawansowania klinicznego choroby wg zaleceń Schmitt i Wozel, uznając wynik PASI o wartości poniżej 7 za łagodny stopień zaawansowania łuszczycy, 7–12 za umiarkowany i powyżej 12 za łuszczycę o ciężkim przebiegu [7]. W badanej grupie było 21 kobiet i 29 mężczyzn w wieku 21–56 lat.
Projekt badawczy uzyskał zgodę Komisji Bioetycznej przy Uniwersytecie Medycznym im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu.
Biorąc pod uwagę stopień nasilenia łuszczycy mierzony wskaźnikiem PASI, chorych podzielono na dwie grupy – z małym i umiarkowanym natężeniem choroby (PASI £ 12), w której znalazło się 22 pacjentów, oraz z dużym natężeniem choroby (PASI > 12), obejmującą dalszych 28 osób. W wyodrębnionych grupach przeprowadzono analizę charakterystyki epidemiologicznej z uwzględnieniem wieku i płci. W ramach rutynowych badań od pacjentów pobrano próbki krwi obwodowej na heparynę litową. Pomiaru poziomu obwodowych limfocytów Treg dokonano z zastosowaniem metody cytometrii przepływowej (FACScan, BD Biosciences, USA) przy użyciu przeciwciał anty-CD3, anty-CD4 i anty-CD25 (BD Biosciences Pharmingen, USA). Grupę kontrolną stanowiło 15 zdrowych osób, wolontariuszy z Regionalnego Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w Poznaniu, dobranych pod względem płci i wieku.
Analizę statystyczną danych przeprowadzono przy użyciu programu Spss v. 15 (SPSS, USA) z zastosowaniem testu U Manna-Whitneya oraz testu c2. Za statystycznie istotną przyjęto wartość p < 0,05.


Wyniki
Średni wiek badanych chorych na łuszczycę wynosił 43,6 roku. Nasilenie objawów klinicznych mierzone wskaźnikiem PASI osiągnęło wartości 7,1–23,4. Nie stwierdzono istotnie statystycznych różnic w charakterystyce epidemiologicznej grupy chorych z wartościami PASI £ 12 w porównaniu z pacjentami ze wskaźnikiem PASI > 12 (p > 0,05).
Odsetek limfocytów Treg o fenotypie CD3+CD4+CD25high w badanej populacji przedstawiono w tab. 1. U chorych z nasilonymi zmianami łuszczycowymi średni odsetek tych komórek wynosił 4,44, u chorych na łuszczycę o przebiegu klinicznym łagodnym i umiarkowanym 7,01, podczas gdy w grupie kontrolnej 8,39. Zaobserwowano statystycznie mniejszy odsetek limfocytów Treg o fenotypie CD3+CD4+CD25high we krwi obwodowej pacjentów z nasilonymi zmianami łuszczycowymi (PASI > 12) w stosunku do grupy kontrolnej (4,44 ±2,2 vs 8,39 ±2,7, p < 0,05). W przypadku grupy pacjentów z małym i umiarkowanym nasileniem choroby (PASI £ 12) odsetek limfocytów Treg był porównywalny z odpowiednim odsetkiem w grupie kontrolnej (7,01 ±2,6 vs 8,39 ±2,7, p > 0,05). Badane grupy chorych na łuszczycę ze wskaźnikiem PASI £ 12 oraz PASI > 12 różniły się odsetkiem obwodowych limfocytów Treg w sposób istotny statystycznie (7,01 ±2,6 vs 4,44 ±2,2, p < 0,05), co przedstawiono na ryc. 1.


Omówienie wyników
Duże zainteresowanie komórkami regulatorowymi doprowadziło w ostatnich latach do ustalenia ich kluczowej roli w kontrolowaniu odpowiedzi immunologicznej poprzez oddziaływanie na efektorowe komórki T. Limfocyty Treg stanowią ok. 5–10% wszystkich komórek T CD4+, pełniąc ważną funkcję w homeostazie obwodowej limfocytów T oraz immunoregulacji [8, 9]. Najlepiej poznanymi z tej heterogennej grupy są naturalnie występujące komórki Treg CD4+CD25+, które wykazują ekspresję receptora dla łańcucha a IL-2 (CD25), antygenu 4 związanego z limfocytami T-cytotoksycznymi (CTLA-4) oraz receptorów z rodziny TNF indukowanych przez glikokortykosteroidy (GITR) [10, 11]. Limfocyty Treg wykazują także ekspresję czynnika Foxp3 (forkhead transcription factor), uznawanego za ich specyficzny marker [8, 12, 13]. Mutacja genu Foxp3, kodującego czynnik transkrypcyjny – skurfinę, prowadzi do niedoborów lub całkowitego braku komórek CD4+CD25+ oraz do rozwoju chorób autoimmunologicznych [8–14]. Zwiększa się liczba danych sugerujących istotną rolę limfocytów Treg o fenotypie CD3+CD4+CD25high w patogenezie łuszczycy [1–3, 5, 6]. Wydaje się, że u pacjentów z łuszczycą zaburzenia proporcji ilościowych między subpopulacją limfocytów Treg a całkowitą subpopulacją limfocytów T CD4+ mogą prowadzić do hiperproliferacji komórek efektorowych. W efekcie dochodzi m.in. do zwiększonej produkcji cytokin prozapalnych przez aktywowane limfocyty, co stymuluje proliferację keratynocytów i komórek endotelialnych [15].
Wyniki przeprowadzonych badań własnych wykazały, że u chorych na łuszczycę odsetek limfocytów Treg CD4+CD25high we krwi obwodowej jest obniżony w porównaniu z populacją osób zdrowych i zależny od ciężkości przebiegu procesu chorobowego skóry, co potwierdza powyższą sugestię. Zaburzenia funkcji i liczby limfocytów Treg stwierdzono w wielu chorobach o podłożu autoimmunologicznym, w tym w łuszczycy, i nadal analizuje się ich rolę w patogenezie tych schorzeń. Po raz pierwszy zmia-ny dotyczące komórek T CD4+CD25+ w skórze i krwi obwodowej u chorych na łuszczycę opisał Sugiyama i wsp. [1], uważając, że różnią się one od komórek Treg osób zdrowych zmniejszoną aktywnością cytotoksyczną. Występowanie w naskórku i skórze właściwej limfocytów CD4+CD25+Foxp3+ potwierdzono także metodami immunohistochemicznymi [16, 17]. Patogeneza łuszczycy nadal pozostaje niewyjaśniona, jednak w wielu badaniach sugeruje się, że pobudzone limfocyty T w zmianach skórnych mogą produkować cytokiny, które odpowiadają następnie za proliferację komórek podstawnych naskórka i za zaburzenia rogowacenia występujące w łuszczycy [18]. Chorobę tę charakteryzuje proces zapalny, za który odpowiada aktywacja patogennych efektorowych limfocytów T. Wydaje się, że zmiany w odsetkach limfocytów Treg we krwi obwodowej i skórze właściwej świadczą o upośledzeniu aktywności tych komórek, co może prowadzić do niekontrolowanego rozwoju procesu zapalnego.
Praca została wykonana w ramach badań własnych Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Nr programu 501-1-4402503-6035.


Piśmiennictwo
1. Sugiyama H, Gyulai R, Toichi E, et al. Dysfunctional blood and target tissue CD4+CD25 high regulatory T cells in psoriasis: mechanism underlying unrestrained pathogenic effector T cell proliferation. J Immunol 2005; 174: 164-73.
2. Kruger JG. The immunologic basis for the treatment of psoriasis with new biologic agents. J Am Acad Dermatol 2002; 46: 1-23.
3. Valdminarsson H, Baker BS, Jonsdottir I, Fry L. Psoriasis: a disease of abnormal proliferation induced by T lymphocytes. Immunol Today 1986; 7: 256-9.
4. Nedoszytko B. Znaczenie subpopulacji limfocytów T w patogenezie łuszczycy. Post Dermatol Alergol 2008; 1: 20-33.
5. Griffiths CE, Barker JN. Pathogenesis and clinical features of psoriasis. Lancet 2007; 370: 263-71.
6. Chen L, Shen Z, Wang G, Fan P, Liu Y. Dynamic frequency of CD4+CD25+Foxp3+ Treg cells in psoriasis vulgaris. J Derm Sci 2008; 51: 200-3.
7. Schmitt J, Wozel G. The Psoriasis Area and Severity Index is the adequate criterion to define severity in chronic plaque – type psoriasis. Dermatology 2005; 210: 194-9.
8. Sakaguchi S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory cells in immunological tolerance to self and non-self. Nat Immunol 2005; 6: 345-52.
9. Piccirillo CA, Shevach EM. Naturally-occuring CD4+CD25+ immunoregulatory T cells: central players in the arena of peripheral tolerance. Semin Immunol 2004; 16: 81-8.
10. Berzofsky JA, Terese M. A novel immunoregulatory axis of NKT cell subsets regulating tumor immunity. Cancer Immunol Immunother 2008; 57: 1679-83.
11. Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, et al. Immunologic self tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25): breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune disease. J Immunol 1995; 155: 1151-64.
12. Shevach EM. Certified professionals: CD4 (+)CD25 (+) supressor T cells. J Exp Med 2001; 193: F41-6.
13. Schwarz RH. Natural regulatory T cells and self-tolerance. Nat Immunol 2005; 6: 327-30.
14. Bach JF. Regulatory T cells under scrutiny. Nat Rev Immunol 2003; 3: 189-98.
15. Ghoreschi K, Weigert C, Röcken M. Immunopathogenesis and role of T cells in psoriasis. Clin Dermatol 2007; 25: 574-80.
16. Bovenschen HJ, van Vlijmen-Willems IM, van de Kerkhof PC, van Erp PE. Identification of lesional CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory cells in psoriasis. Dermatology 2006; 213: 111-7.
17. Fujimura T, Okuyama R, Ito Y, Aiba S. Profiles of Foxp3+ regulatory T cells in eczematous dermatitis, psoriasis vulgaris and mycosis fungoides. Br J Dermatol 2008; 158: 1256-63.
18. Nickoloff BJ, Nestle FO. Recent insights into the immunopathogenesis of psoriasis provide new therapeutic opportunities. J Clin Invest 2004; 113: 1664-75.