Original paper
The contribution of chemokines and chemokine receptors in dermatitis herpetiformis pathogenesis

Wprowadzenie
Opryszczkowate zapalenie skóry (choroba Duhringa, ang. dermatitis herpetiformis – DH) jest przewlekłą chorobą pęcherzową o wielopostaciowym obrazie klinicznym. Zmianom o typie grudek, rumieni, pęcherzy i pęcherzyków towarzyszy silny świąd [1]. Wykazano ponadto związek DH ze zmianami w jelicie cienkim o typie glutenozależnej enteropatii, identycznymi z występującymi w chorobie trzewnej – celiakii [2]. Przyjmuje się wspólną etiologię tych dwóch chorób, w której najważniejszą rolę przypisuje się nietolerancji glutenu – białka zawartego w zbożach europejskich, które cechuje się silnymi właściwościami antygenowymi [3]. W badaniu histopatologicznym zmian skórnych obserwuje się naciek zapalny, w którym obecne mogą być eozynofile, ale dominują neutrofile. Tworzą one mikroropnie (mikroropnie Pierarda) w brodawkach skóry, które następnie przekształcają się w pęcherze podnaskórkowe [4]. Pojawienie się neutrofili poprzedza wczesna akumulacja w skórze limfocytów o profilu CD4+, wydzielających głównie interferon γ (INF-g), czynnik martwicy nowotworów (ang. tumour necrosis factor a – TNF-α) i interleukinę 2 (IL-2), które powodują powstanie późniejszych nacieków z komórek wielojądrzastych [5–7]. Dodatkowo aktywacja kaskady dopełniacza przez przeciwciała IgA oraz MAC (ang. membrane attack complex) może być jednym z mechanizmów wpływających na migrację neutrofili do brodawek skórnych i niszczenie błon komórkowych [8]. Neutrofile tworzące naciek w skórze uwalniają enzymy degradujące macierz i trawiące złogi IgA [9]. Chemokiny to rodzina cytokin biorących udział w procesach fizjologicznych i patologicznych żywych organizmów. Ich nazwa pochodzi od zwrotu chemotaktyczna cytokina (ang. chemotactic, chemoattractant cytokine), w związku z jedną z funkcji, jakie pełnią te białka. Wydzielane są przez leukocyty, keratynocyty, komórki śródbłonka, fibroblasty, a na komórki docelowe oddziaływają za pomocą swoich receptorów, przy czym większość receptorów rozpoznaje więcej niż jedną chemokinę, a niektóre chemokiny reagują z kilkoma receptorami [10].
Cel pracy
Celem pracy było określenie lokalizacji i ekspresji wybranych chemokin (eotaksyna, TARC, MCP-1) i receptorów (CCR-1, CXCR-1 i CXCR-2) w skórze chorych z DH (skórze zmienionej chorobowo oraz pozornie zdrowej) i osób zdrowych oraz ocena stężenia tych chemokin w surowicy u obu grup.
Materiał i metody
Do badania zakwalifikowano 10 osób (5 kobiet i 5 mężczyzn, w wieku 18–58 lat, średnia 44,8 roku) z nowo rozpoznanymi, nieleczonymi zmianami skórnymi w przebiegu DH. U 8 osób zmiany skórne miały charakter pęcherzyków i swędzących grudek, u pozostałych 2 obecne były tylko grudki. U wszystkich chorych włączonych do badania DH rozpoznane zostało na podstawie badania klinicznego, histopatologicznego oraz immunofluorescencji bezpośredniej (ziarniste złogi IgA w brodawkach skóry) i pośredniej (IgAEmA o mianie 1:10–1:320, średnio 1:40). Grupa kontrolna składała się z 10 osób (5 mężczyzn i 5 kobiet, w wieku 19–49 lat, średnia 42 lata). Badanie zostało zaaprobowane przez Komisję Bioetyczną Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, a osoby badane wyraziły na nie świadomą zgodę. Wycinki skóry pobrano ze zmian chorobowych i ze skóry pozornie niezmienionej (pośladki bądź tułów) przed zastosowaniem leczenia (zarówno miejscowego, jak i ogólnego), a u osób zdrowych ze skóry okolic pośladka. Pobierano również u tych samych osób po 5 cm³ krwi żylnej z żyły odłokciowej i po odwirowaniu przechowywano ją w temp. –20°C do czasu wykonania badania metodą ELISA.
Immunohistochemia
Do określenia ekspresji badanych białek zastosowano metodę immunohistochemiczną. Skrawki parafinowe posłużyły do sporządzenia rutynowych preparatów barwionych hematoksyliną i eozyną oraz do badań immunohistochemicznych w systemie detekcyjnym DAKO EnVision wg metody immunoperoksydazowej, z użyciem następujących pierwotnych przeciwciał monoklonalnych: antyeotaksyna, TARC, MCP-1, CCR-1, CXCR-1, CXCR-2, firmy R&D. Do badań immunohistochemicznych skrawki parafinowe po nałożeniu na szkiełka adhezyjne i wysuszeniu w cieplarce w temp. 56°C przez 24 godz. poddawane były odparafinowaniu w szeregu składającym się z ksylenów i alkoholi o zmniejszających się stężeniach (96, 80, 70, 60%). Następnie hamowano aktywność endogennej peroksydazy przy użyciu 3-procentowego roztworu perhydrolu w metanolu przez 5 min. W celu odzyskania antygenowości tkanki i otworzenia drogi dla przeciwciał stosowano procedury zgodne z zaleceniami producenta. Po 60 min inkubacji w temperaturze pokojowej 2-krotnie płukano skrawki w buforze TRIS i stosowano 2-etapowy system wizualizacji DAKO EnVision, aby uwidocznić reakcję antygen – przeciwciało. Pierwszy etap reakcji polega na 30-minutowej inkubacji w powyższych warunkach z polimerem znakowanym peroksydazą i związanym z wtórnymi, kozimi przeciwciałami skierowanymi przeciwko użytym przeciwciałom monoklonalnym (mysim). Ostatni etap detekcji jest przykładem reakcji enzymatycznej, w której przy zastosowaniu substratu dla peroksydazy – tetrachlorku 3,3’diaminobenzydyny (DAB) – powstaje barwny produkt (czas inkubacji z roztworem DAB – 5 min). Po uzyskaniu pozytywnej reakcji immunohistochemicznej podbarwiano jądra komórkowe hematoksyliną Meyera (2 min), a następnie odwadniano skrawki w szeregu alkoholi o rosnących stężeniach (70, 80, 96%) i przeprowadzano przez szereg acetonów i ksylenów. Tak przygotowane zatapiano w balsamie kanadyjskim.
Metodyka badań półilościowych
Nasilenie immunoekspresji eotaksyny, TARC, MCP-1, CCR-1, CXCR-1 i CXCR-2 w wycinkach skóry oceniono półilościowo, stosując następującą skalę: 0 – brak odczynu, odczyn dodatni o niewielkim nasileniu (+1), a odczyn dodatni o stosunkowo znacznym nasileniu (+2).
Badanie metodą immunoenzymatyczną
Stężenie TARC, MCP-1, eotaksyny w surowicy określono za pomocą metody ELISA (R&D, Wielka Brytania). Stężenie przeciwciał określano w pg/ml jako średnią ±SEM (odchylenie standardowe) wg testu U Manna-Whitneya. Za istotne statystycznie uznawano p<0,05. Oznaczono ponadto stężenie przeciwciał przeciw transglutaminazie tkankowej (w klasie IgG i IgA) za pomocą metody ELISA (IBL, Hamburg).
Wyniki

Eotaksyna (CCL11)
W skrawkach pochodzących ze zmian skórnych u osób z chorobą Duhringa dodatnią reakcję z przeciwciałem skierowanym przeciwko eotaksynie wykryto we wszystkich przypadkach. Ekspresję eotaksyny stwierdzono w naskórku, skupiskach komórek nacieku zapalnego pod naskórkiem oraz obumierających tkankach. W skrawkach skóry pobranych z otoczenia zmian nasilenie immunoekspresji eotaksyny było nieznaczne. Obserwowano ekspresję eotaksyny w obrębie dolnej warstwy naskórka i w komórkach nacieku zapalnego w skórze właściwej (ryc. 1.). Nie stwierdzono immunoekspresji eotaksyny w wycinkach skóry pochodzących z grupy kontrolnej.
TARC (CCL17)
W skrawkach pochodzących ze zmian skórnych obserwowano w jednym ocenianym skrawku stosunkowo silny odczyn TARC (ang. thymus and activation-regulated chemokine) w keratynocytach i komórkach zapalnych pod naskórkiem, natomiast w dwóch przypadkach odnotowano ekspresję TARC o nieznacznym nasileniu, dotyczącą keratynocytów (ryc. 2.). W dwóch skrawkach skóry pobranych z otoczenia zmian chorobowych u badanych z chorobą Duhringa nasilenie immunoekspresji TARC w keratynocytach było niewielkie. W jednym przypadku w tej grupie stwierdzono immunoekspresję TARC na komórkach nacieku zapalnego pod naskórkiem. W wycinkach skóry pochodzących z grupy kontrolnej wykryto bardzo słabą, ogniskową immunoekspresję TARC na pojedynczych keratynocytach zlokalizowanych w dolnej warstwie naskórka. W żadnym z wycinków pochodzących od osób z chorobą Duhringa (zarówno w skrawkach z otoczenia zmiany, jak i ze zmian pęcherzowych), a także w żadnym z wycinków pochodzących z grupy kontrolnej nie wykryto immunoekspresji MCP-1.
CCR-1
Wśród ocenianych zmian wykryto dodatnią ekspresję na komórkach zapalnych w dwóch wycinkach. W wycinkach skóry pobranych z okolicy zmian u osób z chorobą Duhringa, komórki CCR-1-dodatnie obecne były w 1 przypadku (ryc. 3.). W żadnym z wycinków pochodzących z grupy kontrolnej nie wykryto immunoekspresji CCR-1.
CXCR-1
We wszystkich wycinkach skóry pochodzących ze zmian chorobowych stwierdzono komórki CXCR-1 (+). W tej grupie nieliczne komórki CXCR-1 (+) odnotowano w 8 przypadkach, natomiast stosunkowo liczne w 2 przypadkach. U 5 osób z chorobą Duhringa stwierdzono komórki CXCR-1 (+) w wycinkach pobranych z otoczenia zmian (ryc. 4.). W żadnym z wycinków pochodzących z grupy kontrolnej nie wykryto immunoekspresji CXCR-1.
CXCR-2
W wycinkach pobranych ze zmian pęcherzowych u osób z chorobą Duhringa we wszystkich przypadkach obecne były komórki CXCR-2 (+). U 5 chorych w tej grupie komórki CXCR-2 (+) były nieliczne, natomiast u pozostałych 5 stwierdzono liczne komórki wykazujące ekspresję CXCR-2 (ryc. 5.). W wycinkach pochodzących z okolicy zmian u osób z chorobą Duhringa w 4 przypadkach odnotowano komórki wykazujące immunoekspresję CXCR-2. W żadnym z wycinków pochodzących z grupy kontrolnej nie wykryto immunoekspresji CXCR-2. Wyniki sumarycznie zebrano w tab. 1.
Chemokiny w surowicy
Stężenia eotaksyny, TARC i MCP-1 były porównywalne u osób z DH i ludzi zdrowych (p>0,05) (tab. 2.). Stężenie transglutaminazy tkankowej IgG i IgA było w surowicy osób chorych na DH (21,4±7,4 i 12,7±3,3) statystycznie większe niż u osób z grupy kontrolnej (2,6±0,2 i 5,1±1,3); p<0,05.
Omówienie wyników
Rekrutacja leukocytów i ich aktywacja w obrębie zmian skórnych w opryszczkowatym zapaleniu skóry jest istotnym, ale wciąż nie do końca poznanym etapem w patogenezie tej choroby. Zdolność do kontrolowania wykwitów chorobowych przez ścisłą dietę bezglutenową sugeruje, że odpowiedź zapalna ze strony błony śluzowej jelit odgrywa krytyczną rolę w patogenezie choroby. Hall i wsp. [11] wykazali zwiększoną ekspresję mRNA E-selektyny w pozornie zdrowej skórze od osób z DH i zwiększone stężenie sE-selektyny, IL-8, TNF-α w surowicy w porównaniu z osobami zdrowymi, co wspiera tezę, że toczący się w błonie śluzowej proces zapalny związany jest z odpowiedzią ogólnoustrojową i aktywacją komórek endotelium w skórze. Autorzy stawiają hipotezę, że zmiany skórne w DH powstają w sytuacji, kiedy początkowo pobudzone neutrofile zostają związane z endotelium i stykają się z cytokinami – których pojawienie się wywołane jest niewielkim urazem – po czym zaczynają przylegać ściśle i przechodzić w kierunku depozytów IgA w skórze [11]. W badaniu autorów ocenie poddana została ekspresja chemokin – białek o właściwościach chemotaktycznych, i ich receptorów, a także stężenie chemokin w surowicy. Eotaksyna wykazująca silne właściwości chemotaktyczne w stosunku do eozynofili i limfocytów typu Th2 produkowana jest przez limfocyty T, eozynofile, monocyty, fibroblasty, komórki endotelium i nabłonkowe jelit oraz układu oddechowego w odpowiedzi na IL-4, IL-13, TNF-α i INF-g [12]. W badaniu autorzy zaobserwowali zdecydowanie większą ekspresję eotaksyny w obrębie zmian skórnych u chorych na DH niż w grupie kontrolnej, ale także u tych samych chorych w skórze pozornie zdrowej. Również Amerio i wsp. [12] wykazali obecność eotaksyny w skórze i mikroropniach ze zmian od chorych z DH. Ekspresji tej chemokiny nie stwierdzono natomiast w skórze osób zdrowych. Ze względu na to, że Bornscheuer i wsp. [13] nie odnotowali ekspresji RANTES czy IL-8 u osób chorych na DH, być może eotaksyna jest głównym chemoatraktantem w tej chorobie w stosunku do limfocytów, eozynofili, mastocytów, jako że we wczesnych zmianach DH obserwuje się naciek złożony z limfocytów TCD4+ [12]. W badaniu Caproni i wsp. [14] stężenie eotaksyny w surowicy osób chorych na DH było porównywalne z wynikami uzyskiwanymi w grupie kontrolnej osób zdrowych, podobnie jak w wynikach autorów. Niniejsza praca jest pierwszą z dostępnej autorom literatury, w której oceniano udział TARC i MCP-1 w chorobie Duhringa. Stężenie tych cytokin w surowicy było porównywalne u osób zdrowych i chorych, natomiast w wycinkach skóry u kilku pacjentów wykazano ekspresję TARC w obrębie zmian skórnych oraz o mniejszym nasileniu w skórze osób chorych, ale poza zmianami chorobowymi. W badaniach autorów tylko ekspresja TARC był obecna w komórkach osób zdrowych, ponieważ należy ona do chemokin wydzielanych zarówno konstytutywnie, jak i po indukcji (tzw. cytokiny prozapalne). Receptory dla TARC obecne są m.in. na neutrofilach, które głównie formują naciek w DH [4, 10, 15]. Keratynocyty ludzkie produkują TARC po stymulacji TNF-α i IFN-g [16]. Amerio i wsp. [12] wykazali ekspresję TNF-α w nacieku zapalnym i komórkach naczyń skóry u chorych na DH. Westernholm-Ormio i wsp. [17], badając ekspresję wybranych cytokin u osób z celiaklią, w wycinkach z jelita cienkiego stwierdzili ekspresję TNF-α i IFN-g, a histologicznie zmiany w jelitach w celiakii i DH są takie same, chociaż w DH mają z reguły mniejsze nasilenie [17]. MCP-1 (ang. monocyte chemoattractant protein) jest chemokiną wykazującą silne działanie na monocyty, limfocyty, bazofile, ale nie na neutrofile czy eozynofile [18, 19]. W badaniach autorów ekspresja MCP-1 nie była obserwowana u żadnego z pacjentów, ale w DH nacieki w skórze chorobowo zmienionej złożone są z neutrofili i prawdopodobnie jest to związane z nieobecnością MCP-1 w badanych wycinkach. Rozpatrując wspólną etiologię DH i celiakii, ciekawe w aspekcie badań autorów niniejszej pracy wydają się prace Palová-Jelínková i wsp. [20] oraz Chowers i wsp. [21]. W chorobie trzewnej spożyta gliadyna przechodzi przez barierę nabłonka jelit i wywołuje odpowiedź immunologiczną, w której – jak się uważa – kluczową rolę odgrywają komórki dendrytyczne. Palová-Jelínková i wsp. [20] stymulowali komórki dendrytyczne gliadyną, co spowodowało ekspresję markerów dojrzewania i wzmożoną sekrecję IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, MCP-1, MCP-2 i RANTES. Chowers i wsp. [21] wykazali u osób z chorobą trzewną po ekspozycji na gluten błony śluzowej odbytnicy (wcześniejsza kilkumiesięczna dieta bezglutenowa) wzrost w błonie śluzowej okrężnicy mRNA dla IL-1β i IL-8 oraz w mniejszym stopniu MCP-1. Chemokiny oddziałują na komórki docelowe przez swoiste receptory. Są to przezbłonowe siedmiohelikalne struktury związane z białkiem G. Większość receptorów rozpoznaje więcej niż jedną chemokinę, a niektóre chemokiny reagują z kilkoma receptorami. Ekspresja CCR-1, będącego receptorem m.in. dla RANTES (CCL5/RANTES; ang. regulated upon activation normal T lymphocyte expressed and secreted) – chemokiny wykazującej dużą aktywność chemotaktyczną w stosunku do eozynofili [22], została wykazana w skórze u kilku osób chorych na DH. Receptor CCR-1 obecny jest na eozynofilach, monocytach i bazofilach, które nie są dominującymi komórkami w nacieku zapalnym w DH [4, 23]. W badaniu autorzy wykazali ekspresję CXCR-1 i CXCR-2 u wszystkich pacjentów w obrębie wycinków ze zmian skórnych. Są to receptory obecne wyłącznie na neutrofilach, ich ligandem jest m.in. IL-8 [23], której rola była wcześniej badana w DH. Interleukina 8 wykazuje dużą aktywność chemotaktyczną dla neutrofili i limfocytów T, ale także eozynofili [23]. Oznaczając IL-8 i IL-6 w warstwie podstawnej naskórka chorych na DH i w skórze osób zdrowych, Graeber i wsp. [24] stwierdzili, że stężenia tych cytokin były większe w skórze osób chorych na DH. Bornscheuer i wsp. [13] wykazali natomiast jednakową dystrybucję IL-8 u osób zdrowych i chorych z DH. Zaobserwowaną różnicę tłumaczą miejscem pobierania wycinków i używaniem innych przeciwciał. Hali i wsp. [11] odnotowali zwiększone stężenie IL-8 w surowicy u 40% badanych osób z chorobą Duhringa. Również w badaniach nad celiaklią Cinova i wsp. [25] wykazali, ze gliadyna indukuje wyraźną produkcję TNF-α i IL-8 przez monocyty pobrane z krwi pacjentów w aktywnym okresie choroby. Podstawę leczenia DH stanowi dieta bezglutenowa. W przypadku zaawansowanych zmian skórnych dodatkowo stosuje się sulfony wpływające tylko na wykwity skórne bez wpływu na zmiany jelitowe [3]. Dapson (4,4’-diaminodifenylosiarczan) zaleca się w leczeniu chorób związanych głównie z naciekami neutrofilowymi. Po jego zastosowaniu obserwuje się redukcję powyższych nacieków. Wykazano, że chemotaksja wywołana przez CXC-L8/IL-8 w warunkach in vitro ulega zmniejszeniu przy stosowaniu dapsonu u osób chorych na pemfigoid [26]. Schmidt i wsp. [26] stwierdzili zależną od dawki dapsonu supresję wydzielania IL-8, mediowaną przez królicze i ludzkie przeciwciała przeciw antygenowi pemfigoidu (BP180) z hodowli keratynocytów. Dapson nie wpływał jednak na stężenie mRNA, co sugeruje jego oddziaływanie na poziomie posttranslacyjnym. Obecność ekspresji chemokin i ich receptorów w obrębie zmian chorobowych w większym nasileniu i w pozornie zdrowym otoczeniu wykwitów skórnych w mniejszym natężeniu potwierdza fakt ich roli w patogenezie DH. Uważa się, że obecność złogów immunoglobulin i komplementu jest pierwszą fazą rozpoczętego procesu destrukcji błony podstawnej, który indukuje wzrost ekspresji chemokin. Związki te nasilają następnie produkcję kolejnych cytokin i enzymów proteolitycznych, które prowadzą do formowania pęcherzy. Wyniki badań autorów niniejszej pracy potwierdzają pojedyncze doniesienia innych autorów dotyczące udziału wybranych pojedynczych chemokin w patogenezie DH.
Praca wykonana z funduszy: KBN nr 507-18-007 oraz Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr: 503-8019-1, 502-18-521.

Piśmiennictwo
1. Wankiewicz A, Gwieździński Z. Zapalenie opryszczkowate skóry w świetle wieloletnich badań klinicznych. Przegl Dermatol 1999; 5: 491-7. 2. Marks J, Shuster S, Watson AJ. Small bowel changes in dermatitis herpetiformis. Lancet 1966; 2: 1280-2. 3. Gawkrodger DJ, Blackwell IN, Gilmour HM, et al. Dermatitis herpetiformis: diagnosis, diet and dermography. Gut 1984; 25: 151-7. 4. Ackerman AB, Chongchitnant N, Sanchez J, et al. Histologic Diagnosis of Inflammatory Skin Disease: A Algorithmic Method Based on Pattern Analysis. Williams & Wilkins, Baltimore 1997. 5. Caproni M, Feliciani C, Fuligni A, et al. Th2-like cytokine activity in dermatitis herpetiformis. Br J Dermatol 1998; 138: 242-7. 6. Garioch JJ, Baker BS, Leonard JN, Fry L. T lymphocytes in lesional skin of patients with dermatitis herpetiformis. Br J Dermatol 1994; 131: 822-6. 7. Graeber M, Baker BS, Garioch JJ, et al. The role of cytokines in the generation of skin lesions in dermatitis herpetiformis. Br J Dermatol 1993; 129: 530-2. 8. Dahl M, Falk J, Carpenter R, et al. Membrane attack complex of complement in dermatitis herpetiformis. Arch Dermatol 1985; 121: 70-2. 9. Reitamo S, Reunala T, Konttinen YT, et al. Inflammatory cells, IgA, C3, fibrin and fibronectin in skin lesions in dermatitis herpetiformis. Br J Dermatol 1981; 105: 167-77. 10. Waśniowska K. Chemokiny – perspektywy zastosowania związków blokujących ich działanie w terapii. Post Hig Med Dośw 2004; 58: 37-46. 11. Hall RP 3rd, Takeuchi F, Benbenisty KM, Streilein RD. Cutaneous endothelial celi activation in normal skin of patients with dermatitis herpetiformis associated with increased serum levels of IL-8, sE-selectin, and TNF-αlpha. J Invest Dermatol 2006; 126: 1331-7. 12. Amerio P, Yerdolini R, Giangiacomi M, et al. Expression of eotaxin, interleukin 13 and tumor necrosis factor-a in dermatitis herpetiformis. Br J Dermatol 2000; 143: 974-8. 13. Bornscheuer E, Zillikens D, Schröder JM, Sticherling M. Lack of expression of interleukin 8 and RANTES in autoimmune bullous skin diseases. Dermatology 1999; 198: 118-21.