Original paper
The role of cyclin expression in superficial and nodular type of basal cell carcinoma

Wprowadzenie
Ostatnio zaobserwowano znaczny wzrost zachorowań na raki skóry, co wiąże się ze zwiększoną ekspozycją ludzi na słoneczne promieniowanie ultrafioletowe, a także z powszechnym korzystaniem ze sztucznych źródeł promieniowania światła [1–3]. Ekspozycji na promieniowanie UV towarzyszy synteza endorfin oraz witaminy D. Niekiedy jednak wraz z ekspozycją na promieniowanie UV dochodzi do powstania natychmiastowych działań niepożądanych, do których zalicza się rozwój rumienia i oparzenia skóry, a także obniżenie odporności na rozwój infekcji bakteryjnych i wirusowych skóry. Do odległych niekorzystnych działań promieniowania ultrafioletowego należą przyspieszone starzenie się skóry (ang. photoaging) oraz rozwój nowotworów skóry. Zdolność promieniowania UV do indukowania tych procesów bez wątpienia wiąże się z jego właściwościami immunomodulującymi, prowadzącymi do supresji nabytej odpowiedzi immunologicznej [4, 5]. Niemelanocytowe raki skóry (ang. nonmelanoma skin cancer – NMSC) – rak podstawnokomórkowy (ang. basal cell carcinoma – BCC) i kolczystokomórkowy (ang. squamosus cell carcinoma – SCC) – jako najczęściej występujące u ludzi stanowią poważny problem współczesnej medycyny, mimo że śmiertelność związana z nimi jest na istotnie niższym poziomie w porównaniu z innymi nowotworami [6]. Rak podstawnokomórkowy stanowi ok. 80% wszystkich nowotworów skóry. Charakteryzuje się miejscową złośliwością i powolnym wzrostem. Najczęstszą lokalizacją jest skóra wcześniej niezmieniona, jednak eksponowana na działanie promieniowania UV, tj. skóra głowy i szyi [7, 8]. Około 15% BCC lokalizuje się na tułowiu, czyli w okolicy zazwyczaj niepoddawanej ekspozycji na promieniowanie UV. Uznaje się, że ok. 60% BCC występujących na skórze tułowia stanowi postać powierzchowna (pBCC), natomiast spośród raków podstawnokomórkowych lokalizujących się na głowie i szyi przeważa (ok. 90%) postać guzkowa (gBCC) [9–11]. Cykl komórkowy jest szeregiem reakcji prowadzących do rozwoju organizmów przez regulację wzrostu, różnicowania, starzenia się i śmierci komórki [12]. Do mechanizmów kontrolujących ten cykl należą liczne cyklinozależne kinazy serynowo-treoninowe (ang. cyclin dependent kinase – CDK) oraz ich podjednostki regulatorowe – cykliny. Występują także liczne endogenne inhibitory CDK, warunkujące m.in. prawidłowe działanie tych białek w poszczególnych fazach cyklu, a także fosforylację specyficznych substratów [13]. Cykl komórkowy składa się z następujących po sobie faz – G1, S (faza syntezy DNA), G2 i M (mitozy) (ryc. 1.). W fazie G1 występują intensywne procesy anaboliczne i proliferacja komórek. W regulacji tego procesu biorą udział syntezowane w tym czasie cykliny A, B, D oraz CDK, m.in. CDK2, CDK4, CDK6, a także białka będące inhibitorami kinaz – p16, p21, p27, retinoblastoma (pRB) i czynnik transkrypcyjny E2F. Cykliny z grupy D (głównie D1) odpowiadają za przebieg fazy G1, cyklina A steruje przebiegiem syntezy DNA, podczas gdy cyklina B1 odgrywa istotną rolę w fazie G2 cyklu komórkowego [14–16]. W fazie G1 wyróżnia się fazę G0, tzw. stanu zrównoważonego metabolizmu, w którym komórki znajdują się w funkcjonalnym spoczynku, wykazując niski poziom syntezy mRNA, białek i enzymów. Długość fazy S wyznaczona jest czasem trwania replikacji DNA. W tej fazie rozpoczyna się synteza cykliny A oraz histonów. Po zakończeniu fazy syntezy komórka wchodzi w fazę G2, podczas której zachodzi sprawdzenie prawidłowości replikacji i naprawa źle sparowanych zasad. W tym czasie następuje także synteza białek niezbędnych do dalszego funkcjonowania, m.in. białek wrzeciona podziałowego (tubuliny) [12]. Prawidłowa ekspresja białek cyklu komórkowego jest niezbędna do właściwej proliferacji komórek. Dysregulacja mechanizmów i ekspresji białek kontrolujących fazy cyklu komórkowego pełni kluczową funkcję w patogenezie nowotworów skóry, w tym raków podstawnokomórkowych [17, 18]. Ze względu na uznaną heterogenność kliniczną i histopatologiczną raków podstawnokomórkowych zwraca uwagę możliwość nieco odmiennego szlaku ich powstawania, dlatego też uzasadnione wydaje się prowadzenie badań analizujących udział białek regulujących przebieg cyklu komórkowego w rozwoju BCC, z uwzględnieniem jego podtypów histologicznych. Cel pracy Celem pracy była ocena różnic w ekspresji cykliny D1, A, B1 u chorych z postacią powierzchowną i guzkową raka podstawnokomórkowego.
Materiał i metody
Materiał badawczy stanowiły 22 osoby rasy kaukaskiej (12 mężczyzn, 10 kobiet, średnia wieku 65,5 roku) z I–IV fototypem skóry ocenianym wg skali Fitzpatricka [19], z rozpoznaną na podstawie badania histopatologicznego odmianą powierzchowną bądź guzkową raka podstawnokomórkowego. Pacjentów leczono w Przyszpitalnej Poradni Kliniki Dermatologii i Wenerologii Uniwer- sytetu Medycznego w Łodzi w latach 2000–2006. Jedenastu z 22 (5 mężczyzn, 6 kobiet, średnia wieku 63 lata) stanowili chorzy z postacią powierzchowną BCC – grupa 1., a kolejnych 11 pacjentów (7 mężczyzn, 4 kobiety, średnia wieku 66 lat) – z postacią guzkową – grupa 2. We wszystkich przypadkach w wycinkach skóry pobranych ze zmian chorobowych określano ekspresję białek regulujących przebieg cyklu komórkowego, tj. cykliny D1, A, B1 przy zastosowaniu metody immunohistochemicznej. Dodatkowo 4 zdrowych ochotników (2 mężczyzn, 2 kobiety, średnia wieku 42 lata) z I–IV fototypem skóry (grupa 3.), od których pobierano wycinki skóry, stanowiło grupę kontrolną do przeprowadzonych analiz immunohistochemicznych. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Lokalnej Komisji Bioetycznej UM w Łodzi, a wszyscy pacjenci wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniu. Kliniczną charakterystykę badanych osób przedstawiono w tab. 1.
Metodyka oznaczeń immunohistochemicznych
Pobrane tkanki umieszczano w 10-procentowym roztworze formaldehydu i zatapiano w parafinie, a następnie krojono na skrawki o grubości 2–3 µm, na których przeprowadzano odczyny immunohistochemiczne. Po od parafinowaniu w szeregu ksylenów i odwodnieniu w szeregu alkoholi skrawki płukano w kilku zmianach wody destylowanej. W celu odzyskania antygenowości tkanek oraz otwarcia drogi dla przeciwciał skrawki gotowano w buforze odsłaniającym o pH 6,9 lub 11 (Dako Cytomation, Target Retrieval Solution – TRS) w kuchence mikrofalowej przy następujących poziomach mocy – 360 W (2 × 6 min), 180 W (2 × 5 min), 90 W (2 × 5 min). Po wystudzeniu skrawki płukano 2-krotnie w 0,05-molowym buforze TRIS (Tris-buffered saline – TBS, Dako Cytomation) o pH 7,6 przez 5 min. Celem zablokowania aktywności endogennej peroksydazy skrawki inkubowano przez 30 min w 0,3-procentowym roztworze nadtlenku wodoru (H₂O2). Następnie poddano je całonocnej inkubacji z pierwotnymi przeciwciałami skie- rowanymi przeciwko następującym antygenom – cyklina D1, A i B1. Przeciwciała pierwotne rozpuszczono w rozcieńczalniku zawierającym komponentę blokującą tło (Dako Cytomation, Antibody Diluent with Background Reducing Components). Inkubację przeprowadzono w komorze wilgotnej w temp. 4°C (inkubacja całonocna) oraz w temperaturze pokojowej (inkubacja 1-godzinna). Po inkubacji skrawki 2-krotnie płukano w buforze TBS, a następnie, żeby uwidocznić reakcję antygen-przeciwciało, stosowano odpowiednie systemy detekcyjne EnVision/HRP/DAB+ dla mysich oraz króliczych przeciwciał pierwotnych (Dako Cytomation). Po 30-minutowej inkubacji skrawków z użyciem wtórnego przeciwciała znakowanego peroksydazą chrzanową przeprowadzano reakcję enzymatyczną, stosując substrat dla peroksydazy – tetrachlorek 3,3-diaminobenzydyny (DAB). Po zakończeniu reakcji immunohistochemicznej jądra komórkowe podbarwiano hematoksyliną wg Meyera (2 min), a następnie odwadniano w wielu alkoholach o zwiększających się stężeniach, przeprowadzano przez wiele ksylenów i zaklejano DPX. Korzystając z powyżej opisanej procedury immunohistoche- micznej, kontrolę negatywną stanowiły skrawki, w których pierwotne przeciwciało zastąpiono buforem TBS. Szczegółową charakterystykę stosowanych przeciwciał przedstawiono w tab. 2. Następnie preparaty podbarwiano hematoksyliną, odparowywano i przykrywano szkiełkami nakrywkowymi. Negatywną kontrolę stanowiły skrawki, które nie były inkubowane z pierwszorzędowym przeciwciałem. Liczbę komórek wykazujących ekspresję jądrową poszczególnych białek zliczano w powiększeniu 400× przy zastosowaniu programu komputerowego SIS analysis (Olympus, Japonia). Średnią liczbę komórek z dodatnią ekspresją badanych białek na 100 analizowanych komórek w trzech różnych polach widzenia obliczano u każdego pacjenta w guzie, a u zdrowych ochotników w naskórku. Analiza statystyczna W celu porównań statystycznych poza obliczeniem średniej arytmetycznej i odchylenia standardowego posłużono się obliczaniem mediany, dolnego, górnego kwartyla, wartości minimum i maksimum. Do oceny istotności różnic badanych parametrów (liczby komórek, w których ekspresji ulegały cykliny D1, A i B1) między dwoma grupami zastosowano test U Manna-Whitneya. W celu uniknięcia błędów związanych z powtarzaną aplikacją testu U Manna-Whitneya, przy jednoczesnym porównywaniu kilku grup, do oceny istotności różnic zastosowano test Kruskala-Wallisa. Dla wszystkich porównań i korelacji istotność statystyczną uznawano przy p<0,05.

Wyniki

Cyklina D1
Średnia liczba komórek wykazujących ekspresję cykliny D1 w biopsjach pobranych z postaci powierzchownej raka podstawnokomórkowego wynosiła 18,5/100 komórek (5,3–39, odchylenie standardowe – OS 10,9), z postaci guzkowej 9,6/100 komórek (0,0–43,3, OS 13,3), a z grupy kontrolnej 0,3/100 komórek (0,0–0,7, OS 0,3). Analizując liczbę komórek wykazujących ekspresję cykliny D1, stwierdzono istotnie większą ich liczbę w wycinkach pobranych z pBCC (grupa 1.) i gBCC (grupa 2.) niż w porównywanej grupie kontrolnej (p<0,05). Liczba komórek wykazujących ekspresję cykliny D1 była istotnie większa w odmianie powierzchownej BCC niż w postaci guzkowej (p=0,04) (tab. 3., ryc. 2.).
Cyklina A
Średnia liczba komórek wykazujących ekspresję cykliny A w biopsjach pobranych z postaci powierzchownej raka podstawnokomórkowego wynosiła 7,9/100 komórek (2,0–13,0, OS 3,4), z postaci guzkowej 11,2/100 komórek (1,6–24,3, OS 7,6), a w grupie kontrolnej 2,3/100 komórek (1,3–3,3, OS 0,8). Liczba komórek wykazujących ekspresję cykliny A była istotnie większa w grupie 1. i 2. w porównaniu z grupą kontrolną (odpowiednio p=0,01, p=0,04). Nie stwierdzono różnic między ekspresją cykliny A a typem histopatologicznym BCC (p>0,05) (tab. 3., ryc. 3.).
Cyklina B1
Średnia liczba komórek wykazujących ekspresję cykliny B1 w biopsjach pobranych z postaci powierzchownej raka podstawnokomórkowego wynosiła 4,6/100 komórek (0–16,3, OS 5,5), z postaci guzkowej 18,3/100 komórek (0,3–62,3, OS 19,3), podczas gdy w grupie kontrolnej była najwyższa i wynosiła 44,3/100 komórek (39,0–49,0, OS 4,1). Istotnie statystycznie niższą ich liczbę wykazano zarówno w grupie pBCC, jak i gBCC w porównaniu z grupą kontrolną (odpowiednio p=0,004, p=0,02). Również w tym przypadku nie stwierdzono różnic między ekspresją cykliny B1 a typem histopatologicznym BCC (p>0,05) (tab. 3., ryc. 4.).
Omówienie
Prawidłowa ekspresja białek cyklu komórkowego okazuje się niezbędna do właściwej proliferacji komórek. Przejście komórki przez kolejne fazy cyklu kontrolowane jest przez wiele mechanizmów, w których istotną rolę odgrywają kinazy cyklinozależne. Wiele danych piśmiennictwa wskazuje, że akumulacja uszkodzeń na poziomie genów, prowadząca do dysregulacji ekspresji kodowanych białek cyklu komórkowego, pełni kluczową funkcję w procesie skórnej kancerogenezy [17, 20, 21]. Przechodzenie komórki przez poszczególne fazy cyklu jest sterowane przez cykliny, cyklinozależne kinazy oraz ich inhibitory. Mutacje w genach kodujących białka regulatorowe cyklu komórkowego stwierdzono w różnych rodzajach nowotworów. W komórkach prawidłowych CDK, kierując cyklem komórkowym, ulegają fosforylacji i defosforylacji, tj. procesom, które są niezbędne dla prawidłowego podziału komórki. Chociaż CDK są obecne przez cały czas, to jednak ich aktywność jest ograniczona do ściśle określonych punktów czasowych cyklu komórkowego. Cykliny w odróżnieniu od CDK są syntetyzowane jedynie podczas określonych faz cyklu komórkowego i po aktywacji zależnych od siebie kinaz ulegają szybkiej degradacji. Maksymalne stężenie cyklin występuje w metafazie/anafazie mitozy, po czym ulega ono zmniejszeniu na skutek trawienia ich przez proteazy. Regulacja stężenia cyklin odgrywa kluczową rolę w prawidłowym funkcjonowaniu cyklu komórkowego [22]. Na początku fazy G1 syntetyzowana jest cyklina D1 regulująca aktywność kinaz CDK4 i CDK6. Kolejny etap tego procesu stanowi synteza DNA sterowana przez pojawienie się kompleksu cykliny A i kinazy CDK2 w sąsiedztwie replikującego materiału genetycznego jądra. W następnym etapie (faza G2) główną rolę odgrywa cyklina B1. Aktywny kompleks cyklina B1/CDK1 jest czynnikiem promującym mitozę, a jego inaktywacja powoduje wyjście komórki z mitozy. Degradacja cykliny B1 w końcowych fazach mitozy wprowadza komórkę w fazę G1 kolejnego cyklu. Powszechnie uznanym zjawiskiem jest zaburzenie ekspresji tych niezbędnych regulatorów cyklu komórkowego w rakach skóry [23]. Do chwili obecnej większość badań było jednak przeprowadzanych w warunkach in vitro bądź na modelach zwierzęcych [24–27]. Tylko w pojedynczych pracach analizowano ekspresję tych białek w warunkach in vivo w niemelanocytowych rakach skóry. Wyniki badań przeprowadzonych na modelu zwierzęcym oceniających ekspresję cykliny D1 w stanach przedrakowych oraz rakach kolczystokomórkowych wykazały istotnie wyższą ekspresję tego białka w rakach niż w stanach je poprzedzających [24]. Z tymi wynikami zgodne są również obserwacje innych autorów [25–27], którzy nadekspresję tej proteiny wykazali w raku kolczystokomórkowym (model zwierzęcy). Dane te wskazują na istotny udział cykliny D1 w rozwoju i progresji NMSC. Inohara i wsp. [28], przeprowadzając badanie w kierunku obecności cyklin D1 w wycinkach skóry pochodzących z histiocytoma, raka kolczystokomórkowego i czerniaka, wykazali obecność tej proteiny jedynie w guzach złośliwych, uznając tym samym cyklinę D1 za marker złośliwości guza. Inni autorzy [29], badając liczbę kopii genu dla cykliny D1 i jej ekspresję w różnych postaciach czerniaka, stwierdzili pozytywną korelację między obecnością tego białka a złośliwością nowotworu. Autorzy sugerują, że cyklina D1 może być uznana za onkogen w melanoma malignum, który być może w przyszłości stanie się celem strategii terapeutycznych. Liang i wsp. [30], analizując ekspresję cykliny D1 w 127 przypadkach raków podstawnokomórkowych, wykazali jej obecność w ponad 50% BCC, przy jednoczes- nym braku ekspresji w niezmienionej chorobowo tkance otoczenia guza. Podobne wyniki uzyskali Staibano i wsp. [31], którzy badając 60 wycinków pobranych z różnych typów histopatologicznych BCC, odnotowali zwiększoną liczbę komórek cykliny D1(+) w połowie przypadków oraz dodatnią korelację między nasileniem jej ekspresji a agresywnością guza. Analogiczne zależności wykazano w badaniu własnym, obserwując nadekspresję cykliny D1 w bioptatach pobranych od osób z BCC. Ponadto stwierdzono większą liczbę komórek wykazujących ekspresję cykliny D1 w odmianie powierzchownej niż guzkowej BCC, co może świadczyć o większym uszkodzeniu mechanizmów naprawczych komórki w tym typie histopatologicznym guza. Do chwili obecnej jedynie w pojedynczych pracach analizowano udział ekspresji cykliny A i B w nowotworach skóry. W badaniach Tran i wsp. [32] wykazano wyższą ekspresję tych białek w czerniaku w porównaniu ze znamionami melanocytowymi. Autorzy wykazali pozytywną korelację między ekspresją cyklin a inwazyjnością czerniaka, co ma istotne znaczenie w dalszym rokowaniu. W kolejnym eksperymencie ten sam zespół badaczy, analizując zmiany o typie rogowiaka kolczystokomórkowego i SCC, odnotował zwiększoną ekspresję cykliny A i B w obu grupach, jednak nie stwierdził różnic w ekspresji białek między tymi jednostkami chorobowymi. Autorzy sugerowali, że w rozwoju obu typu zmian dochodzi do dysregulacji mechanizmów kontrolujących cykl komórkowy [33]. Nad-ekspresję cykliny A obserwowano również w zmianach o typie rogowacenia słonecznego, chorobie Bowena i rakach kolczystokomórkowych. Badacze wykazali istotny wzrost poziomu jej ekspresji wraz ze zwiększeniem agresywności zmian chorobowych, z największym jej nasileniem w przypadkach nisko zróżnicowanych raków kolczystokomórkowych [34]. W dostępnym piśmiennictwie brakuje danych analizujących ekspresję cyklin A i B w rakach podstawnokomórkowych. W przeprowadzonym badaniu własnym stwierdzono istotnie większą liczbę komórek wykazujących ekspresję cykliny A w obu typach BCC w porównaniu z grupą kontrolną, w której nie obserwowano ekspresji tego białka. Uzyskane wyniki wskazują na dysregulację cyklu komórkowego w rakach podstawnokomórkowych, prowadzącą do jego zahamowania. Zmniejszony w porównaniu z grupą kontrolną poziom ekspresji cykliny B1 w pBCC i gBCC może również przemawiać za zahamowaniem cyklu komórkowego w jego początkowych fazach (G1 i S), w których rozpoczyna się synteza tego białka. Różnice w ekspresji cykliny B w analizowanej grupie BCC w odniesieniu do agresywnych raków skóry (SCC, MM) potwierdzają mniejszą agresywność raków podstawnokomórkowych. Uzyskane wyniki wykazujące odmienną ekspresję cykliny D1 w postaci powierzchownej i guzkowej BCC mogą świadczyć o odmiennych mechanizmach rozwoju tych najczęstszych postaci raków podstawnokomórkowych.
Praca finansowana z funduszy statutowych UM nr 503-1-1019 oraz pracy własnej nr 502-11-725.

Piśmiennictwo
1. Poorsattar SP, Hornung RL. UV light abuse and high-risk tanning behavior among undergraduate college students. J Am Acad Dermatol 2007; 56: 375-9. 2. Stryker JE, Yaroch AL, Moser RP, et al. Prevalence of sunless tanning product use and related behaviors among adults in the United States: results from a national survey. J Am Acad Dermatol 2007; 56: 387-90. 3. Neale R, Davis M, Pandeya N, et al. Basal cell carcinoma on the trunk is associated with excessive sun exposure. J Am Acad Dermatol 2007; 56: 380-6. 4. Garssen J, van Loveren H. Effects of ultraviolet exposure on the immune system. Crit Rev Immunol 2001; 21: 359-97. 5. Grant WB, Holick MF. Benefits and requirements of vitamin D for optimal health: a review. Altern Med Rev 2005; 10: 94-111. 6. Shemesh S, Spencer JM, Phelps RG. Pattern of development of basal versus squamous cell carcinoma. J Drugs Dermatol 2006; 5: 40-4. 7. Diffey BL. Analysis of the risk of skin cancer from sunlight and solaria in subjects living in northern Europe. Photodermatol 1987; 4: 118-26. 8. Lovatt TJ, Lear JT, Bastrilles J, et al. Associations between ultraviolet radiation, basal cell carcinoma site and histology, host characteristics, and rate of development of further tumors. J Am Acad Dermatol 2005; 52: 468-73. 9. McCormack CJ, Kelly JW, Dorevitch AP. Differences in age and body site distribution of the histological subtypes of basal cell carcinoma. A possible indicator of differing causes. Arch Dermatol 1997; 133: 593-6. 10. Bastiaens MT, Hoefnagel JJ, Bruijn JA, et al. Differences in age, site distribution, and sex between nodular and superficial basal cell carcinoma indicate different types of tumors. J Invest Dermatol 1998; 110: 880-4. 11. Kuzmina N, Talme T, Lapins J, Emtestam L. Non-invasive preoperative assessment of basal cell carcinoma of nodular and superficial types. Skin Res Technol 2005; 11: 196-200. 12. Lo Muzio L, Staibano S, Pannone G, et al. Expression of cell cycle and apoptosis-related proteins in sporadic odontogenic keratocysts and odontogenic keratocysts associated with the nevoid basal cell carcinoma syndrome. J Dent Res 1999; 78: 1345-53. 13. Wohlbold L, Larochelle S, Liao JC, et al. The cyclin-dependent kinase (CDK) family member PNQALRE/CCRK supports cell proliferation but has no intrinsic CDK-activating kinase (CAK) activity. Cell Cycle 2006; 5: 546-54. 14. Kim AL, Athar M, Bickers DR, Gautier J. Ultraviolet-B-induced G1 arrest is mediated by downregulation of cyclin-dependent kinase 4 in transformed keratinocytes lacking functional p53. J Invest Dermatol 2002; 118: 818-24. 15. Gambichler T, Skrygan M, Hyun J, et al. Cytokine mRNA expression in basal cell carcinoma. Arch Dermatol Res 2006; 298: 139-41. 16. Bhoumik A, Fichtman B, Derossi C, et al. Suppressor role of activating transcription factor 2 (ATF2) in skin cancer. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: 1674-9. 17. Tilli CM, Van Steensel MA, Krekels GA, et al. Molecular aetiology and pathogenesis of basal cell carcinoma. Br J Dermatol 2005; 152: 1108-24. 18. Adolphe C, Hetherington R, Ellis T, Wainwright B. Patched1 functions as a gatekeeper by promoting cell cycle progression. Cancer Res 2006; 66: 2081-8. 19. Fitzpatrick TB. The validity and practicality of sun-reactive skin types I through VI. Arch Dermatol 1988; 124: 869-71. 20. Soufir N, Molés JP, Vilmer C, et al. P16 UV mutations in human skin epithelial tumors. Oncogene 1999; 18: 5477-81. 21. Moloney FJ, Comber H, Conlon PJ, Murphy GM. The role of immunosuppression in the pathogenesis of basal cell carcinoma. Br J Dermatol 2006; 154: 790-1. 22. Schafer KA. The cell cycle: a review. Vet Pathol 1998; 35: 461-78. 23. Kuźbicki L, Aładowicz E, Chwirot BW. Cyclin-dependent kinase 2 expression in human melanomas and benign melanocytic skin lesions. Melanoma Res 2006; 16: 435-44. 24. Bianchi AB, Fischer SM, Robles AI, et al. Overexpression of cyclin D1 in mouse skin carcinogenesis. Oncogene 1993; 8: 1127-33. 25. Balasubramanian S, Ahmad N, Jeedigunta S, Mukhtar H. Alterations in cell cycle regulation in mouse skin tumors. Biochem Biophys Res Commun 1998; 243: 744-8. 26. Robles AI, Conti CJ. Early overexpression of cyclin D1 protein in mouse skin carcinogenesis. Carcinogenesis 1995; 16: 781-6. 27. Zhang SY, Liu SC, Goodrow T, et al. Increased expression of G1 cyclins and cyclin-dependent kinases during tumor progression of chemically induced mouse skin neoplasms. Mol Carcinog 1997; 18: 142-52. 28. Inohara S, Kitagawa K, Kitano Y. Expression of cyclin D1 and p53 protein in various malignant skin tumors. Dermatology 1996; 192: 94-8. 29. Sauter ER, Yeo UC, von Stemm A, et al. Cyclin D1 is a candidate oncogene in cutaneous melanoma. Cancer Res 2002; 62: 3200-6. 30. Liang SB, Furihata M, Takeuchi T, et al. Overexpression of cyclin D1 in nonmelanocytic skin cancer. Virchows Arch 2000; 436: 370-6. 31. Staibano S, Lo Muzio L, Pannone G, et al.; Association of directors of anatomic and surgical pathology. DNA ploidy and cyclin D1 expression in basal cell carcinoma of the head and neck. Am J Clin Pathol 2001; 115: 805-13. 32. Tran TA, Ross JS, Carlson JA, Mihm MC Jr. Mitotic cyclins and cyclin-dependent kinases in melanocytic lesions. Hum Pathol 1998; 29: 1085-90. 33. Tran TA, Ross JS, Boehm JR, Carlson JA. Comparison of mitotic cyclins and cyclin-dependent kinase expression in keratoacanthoma and squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol 1999; 26: 391-7. 34. Brasanac D, Boricic I, Todorovic V, et al. Cyclin A and beta-catenin expression in actinic keratosis, Bowen's disease and invasive squamous cell carcinoma of the skin. Br J Dermatol 2005; 153: 1166-75.