Special work
The genetic diagnostics of primary cutaneous T-cell lymphomas. Part III: The comparison of abnormal cell clone incidence in cutaneous T-cell lymphomas using molecular method of TCRγ rearrangement and cytogenetic techniques

Wstęp
Chłoniaki T-komórkowe wywodzące się pierwotnie ze skóry (ang. cutaneous T-cell lymphoma – CTCL) stanowią niejednorodną grupę nowotworów, z których najczęstszymi są ziarniniak grzybiasty (ang. mycosis fungoides – MF) i zespół Sezary’ego (ang. Sezary syndrome – SS). Diagnostyka CTCL, mimo dość wyraźnych kryteriów, jest wciąż trudna. Szczególnie dotyczy to wczesnych stadiów chłoniaków, które klinicznie mogą imitować choroby zapalne, np. wyprysk, atopowe zapalenie skóry, łuszczycę, przyłuszczycę, liszaj płaski, a nawet erytrodermię [1, 2]. Dużym problemem diagnostycznym w przypadku CTCL jest wczesna detekcja komórek nowotworowych w skórze i we krwi obwodowej. Jedna z metod ich identyfikacji to wykrywanie we krwi obwodowej komórek Lutznera (Sezary’ego), które mają duże, pofałdowane jądro komórkowe (mózgokształtne – cerebriforme). Obecność tych komórek w liczbie >1000/mm³ stanowi cechę diagnostyczną w SS. Jednak fakt wykrywania komórek Lutznera w innych, nienowotworowych ww. dermatozach obarcza tę metodę dużym błędem i nie zawsze pozwala na jednoznaczną interpretację wyników [1, 2].
Obecnie duże nadzieje we wczesnej diagnostyce CTCL wiąże się z badaniem cytogenetycznym oraz molekularnym, opierającym się na wykrywaniu nieprawidłowych klonów komórek T za pomocą analizy rearanżacji genów TCRγ [2–7].
W przedstawianej pracy porównano częstość występowania nieprawidłowych klonów komórkowych w pierwotnych chłoniakach T-komórkowych skóry analizowanych za pomocą metody cytogenetycznej oraz molekularnej z zastosowaniem analizy rearanżacji genów TCRγ.
Materiał i metody
Materiał badań stanowiły biopsje skóry, węzłów chłonnych oraz krew obwodowa, pochodzące od 31 pacjentów Kliniki Dermatologii Akademii Medycznej z rozpoznaniem CTCL [25 przypadków MF, 3 SS, 2 anaplastycznego chłoniaka wielokomórkowego CD30+ (cutaneous anaplastic large cell lymphoma – C-ALCL) i 1 angiocentrycznego chłoniaka z komórek NK/T].
Badanie cytogenetyczne polegało na analizie aberracji chromosomowych w metafazach uzyskanych z hodowli limfocytów krwi obwodowej pobranej od 27 pacjentów z CTCL (17 przypadków MF, 7 SS, 2 C-ALCL i 1 pacjent z angiocentrycznym chłoniakiem z komórek NK/T), barwionych metodą GTG (trypsyna + Giemsa). Zgodnie z ogólnie przyjętymi zasadami za aberrację klonalną uznawano taką, która występowała u pacjenta w 2 metafazach (aberracje strukturalne) lub 3 metafazach (aberracje liczbowe).
W celu wykrycia rearanżacji genów TCRγ badano tkanki pochodzące od 31 pacjentów z CTCL (25 przypadków MF, 3 SS, 2 C-ALCL i 1 angiocentrycznego chłoniaka z komórek NK/T). Z wycinków skórnych i fragmentów węzłów chłonnych przechowywanych w temperaturze –80°C izolowano genomowy DNA za pomocą zestawu A&A Biotechnology (Polska) i następnie przeprowadzono łańcuchową reakcję polimerazy z użyciem 3 mieszanin starterów komplementarnych do odcinka łączącego V-J TCRγ, jak opisano poprzednio [3]. Otrzymane produkty rozdzielano metodą elektroforezy w gradiencie temperatur (HD-TGGE) i/lub na żelu denaturującym MDE-PAGE. Uzyskane produkty rozdziału analizowano i archiwizowano przy użyciu programu komputerowego FOTOAnalyst PC Image firmy Fotodyne.
Wyniki
Analiza cytogenetyczna pacjentów z MF wykazała obecność aberracji chromosomowych u 11 (64,3%) z 17 badanych. Klonalne aberracje chromosomowe wykrywano u 4 chorych (wyłącznie liczbowe u 3 pacjentów i aberrację strukturalną u 1 pacjenta), natomiast u 7 występowały aberracje nieklonalne. Wszyscy chorzy z aberracjami chromosomowymi byli w stadium zaawansowania CTCL co najmniej II (T1,2 lub 3, N0,1, M0). Kariotyp prawidłowy stwierdzono u 6 pacjentów, spośród których 3 było w stadium I zaawansowania, a 3 w stadium II. Monoklonalność genów TCRγ wykryto u 64% pacjentów z MF – wszyscy byli w co najmniej II stadium zaawansowania choroby (tab. 1.).
U wszystkich pacjentów z zespołem Sezary’ego wykrywano klonalne aberracje chromosomowe. Poza 1 przypadkiem z delecją del(8)(p21), jako jedyną zmianą w komórkach, kariotyp pozostałych pacjentów był najczęściej złożony, z licznymi aberracjami strukturalnymi i liczbowymi. Odnotowano okołodiploidalną liczbę chromosomów z klonami poliploidalnymi. Obserwowane aberracje chromosomowe prowadziły najczęściej do utraty materiału chromosomów 2, 9, 10, 13 i 17. Wyniki badań cytogenetycznych pacjentów przedstawiono w tab. 2. i 3. Przykładowe kariotypy zamieszczono na ryc. 1. i 2.
Aberracje chromosomalne stwierdzono także u 1 z 2 pacjentów z CTCL CD30+. Kariotyp pozostałych pacjentów z tej grupy był prawidłowy (wyniki tab. 2.–3.). Monoklonalność genów TCRγ odnotowano u wszystkich pacjentów z SS, C-ALCL, a także u pacjenta z angiocentrycznym chłoniakiem z komórek NK/T. Zestawienie badań cytogenetycznych oraz molekularnych przedstawia tab. 3. Łącznie w badaniu molekularnym monoklonalność wykryto u 22 (71%) spośród 31 badanych z CTCL, natomiast obecność klonalnych aberracji chromosomowych u 19 (70,4%) spośród 27 badanych z CTCL.
Dyskusja
Pomimo wyraźnego określenia kryteriów diagnostycznych CTCL, ich diagnostyka nadal nie jest łatwa. Oprócz badania histopatologicznego oraz immunohistochemicznego skóry, powiększonych węzłów chłonnych, szpiku i badań obrazowych narządów wewnętrznych, współczesna diagnostyka oferuje możliwość oceny klonalności rearanżacji genów receptora TCR oraz analizę aberracji chromosomalnych zarówno w skórze, jak i we krwi chorych [1, 3, 7, 8].
Zastosowanie metody łańcuchowej reakcji polimerazy PCR oraz elektroforezy o wysokiej rozdzielczości pozwala na wykrywanie klonu TCR we krwi u ok. 40% pacjentów z MF, natomiast w skórze w 90% przypadków MF [9–13]. Ogólnie nieprawidłowe klony komórkowe wykrywano w 40–90% wszystkich CTCL [14].
W przeprowadzonych badaniach monoklonalność genu TCRγ stwierdzono u 64% pacjentów z MF, u wszystkich pacjentów z SS, C-ALCL, a także u pacjenta z angiocentrycznym chłoniakiem z komórek T/NK typu nosowego. Łącznie monoklonalność wykryto u 22 (71%) spośród 31 badanych CTCL, co jest wynikiem zgodnym z badaniami innych autorów [2, 14]. Monoklonalność rearanżacji genów TCRγ korelowała z obrazem klinicznym CTCL oraz ze stopniem zaawansowania choroby. Poliklonalność rearanżacji odnotowano we wczesnych stadiach MF, natomiast monoklonalność raczej w późnych stadiach MF i SS.
Stwierdzenie monoklonalności genów TCR zostało uznane za niezależny negatywny czynnik prognostyczny w odpowiedzi CTCL na leczenie [13]. W większości przypadków zaobserwowano identycznie zrearanżowany klon w skórze, węzłach chłonnych i krwi pacjentów z CTCL [13]. Znajdowano także różne klony zrearanżowanego genu TCR w skórze i węzłach chłonnych u ok. 1/3 pacjentów z MF [12]. Stwierdzenie monoklonalności genów TCR nie jest jednoznaczne ze złośliwością procesu chorobowego [15]. Odnotowano bowiem jej obecność we krwi zdrowych osób oraz w skórze pacjentów z dermatozami zapalnymi [15–18]. Istnienie klonu nowotworowego w tych przypadkach zależało od wieku i wiązało się głównie z komórkami CD8+ [19].
Występowanie aberracji chromosomowych jest jedną z cech komórek nowotworowych, która pozwala na ich odróżnienie od komórek prawidłowych. U chorych z MF/SS aberracje wykrywa się w ok. 60% przypadków, najczęściej w zaawansowanych stadiach tych chłoniaków. Kariotyp opisanych do tej pory przypadków MF/SS był często złożony, z licznymi aberracjami strukturalnymi i liczbowymi. Nie wykryto dotychczas swoistej, powtarzalnej aberracji chromosomowej [7, 20–25].
W badanych przez autorów artykułu przypadkach MF/SS, aberracje chromosomowe obserwowano u wszystkich pacjentów z SS, a tylko u 64% chorych z MF. Złożoność aberracji chromosomowych korelowała ze stadium klinicznym zaawansowania choroby.
Cechą badanych pacjentów z MF/SS była niestabilność chromosomowa, objawiająca się zmiennością kariotypową oraz występowaniem licznych komórek z nieklonalnymi aberracjami strukturalnymi. Zjawisko takie obserwowali także inni autorzy, co wskazuje na niestabilność genetyczną komórek MF/SS [21, 24, 26, 27]. Dostrzeżone w badaniu aberracje chromosomowe prowadziły najczęściej do utraty materiału chromosomów 2, 9, 10, 13 i 17, co jest zgodne z obserwacjami innych autorów [20–25] i może wiązać się z utratą zlokalizowanych w tych chromosomach genów supresorowych CDKN2A i 2B (locus 9p21), RB1 (locus 13q), PTEN (locus 10q) i TP53 (locus 17p) [20–25].
Obecność aberracji chromosomalnych obok rearanżacji TCR przemawia za klonalną ekspansją komórek T. Wykrycie aberracji może przemawiać za zbliżającym się nawrotem choroby lub jej postępem [19, 28]. Obecność komórek z takimi samymi klonalnymi aberracjami chromosomowymi niektórzy badacze [28–31] wykrywali nie tylko we krwi, ale także w skórze i węzłach chłonnych osób zdrowych.
Związek klonalności genów TCR z obecnością zaburzeń chromosomalnych opisywano już w chłoniakach. Stwierdzono np. trisomię chromosomu 7 w linii nowotworowych komórek wywodzących się z CTCL równolegle do 3 klonalnie zrearanżowanych odcinków TCRb zarówno w tej linii komórek, jak i w skórze oraz krwi pacjenta, od którego ta linia się wywodziła [32]. Trisomię chromosomu 7 spotyka się także w tkankach bez złośliwego procesu rozrostowego i najprawdopodobniej wiąże się z wiekiem, przez co nie może być markerem złośliwości procesu [2, 33].
Wykazywano także na poziomie pojedynczej komórki, że nowotworowe limfocyty T wykazują zarówno rearanżacje monoklonalne TCRγ, jak i mikroskopowo wykrywalne aberracje chromosomowe stanowiące wspólnie wyznacznik złośliwości procesu [34].
W przypadku C-ALCL monoklonalność TCR stwierdza się w większości przypadków. Monoklonalny rozrost w obu przypadkach C-ALCL może być potwierdzeniem tych wyników. Za pomocą badania cytogenetycznego aberracje wykryto tylko w 1 przypadku tego chłoniaka. Nie wykryto t(2;5), swoistej dla ALCL CD30+ o pozaskórnym pochodzeniu, co potwierdzać może fakt rzadkiego występowania tej aberracji w skórnej postaci ALCL [33, 34].
W pozawęzłowym chłoniaku z komórek NK/T typu nosowego w większości przypadków odnotowuje się konfigurację germline genu TCR. Rearanżację monoklonalną stwierdza się niezmiernie rzadko w odmianie o fenotypie limfocytów T cytotoksycznych [2, 13]. Cechą kariotypu tych guzów jest delecja długich ramion chromosomu 6 [34]. Badany przypadek chłoniaka angiocentrycznego z komórek T/NK typu nosowego wykazywał monoklonalność genów TCRγ i brak klonalnych aberracji chromosomowych.
Łącznie w przeprowadzonych badaniach testami molekularnymi monoklonalność wykryto u 22 (71%) spośród 31 badanych z CTCL, natomiast obecność klonalnych aberracji chromosomowych stwierdzono u 19 (70,4%) spośród 27 badanych z CTCL, co daje porównywalną czułość dwóch metod w wykrywaniu klonalnych rozrostów nowotworowych. Podobne wyniki uzyskali w swoich badaniach Muche i wsp. [2].
Za pomocą badania cytogenetycznego wykrywa się niewielkie klony komórkowe. Pozwala to na śledzenie progresji nowotworu i klonalnej ewolucji komórek nowotworu, jednak jego wykonanie jest czasochłonne i wymaga dużego doświadczenia badacza. Za badaniem klonalności za pomocą metod analizy rearanżacji genu receptora TCR przemawia wysoka czułość, szybkość wykonania badania i mniejsza pracochłonność, jednak wykrywanie monoklonalności u niektórych osób zdrowych oraz osób z dermatozami zapalnymi ogranicza jego wartość diagnostyczną.
W podsumowaniu przeprowadzone badania wskazują na komplementarność metody cytogenetycznej i molekularnej opartej na analizie rearanżacji genu TCRγ w diagnostyce i monitorowaniu CTCL.
Piśmiennictwo
1. Willemze R, Jaffe ES, Burg G, et al. WHO-EORTC classification for cutaneous lymphomas. Blood 2005; 105: 3768-85.
2. Marcus Muche J, Karenko L, Gellrich S, et al. Cellular coincidence of clonal T cell receptor rearrangement and complex clonal chromosomal aberrations – a hallmark of malignancy in cutaneous T cell lymphoma. J Invest Dermatol 2004; 122: 574-8.
3. Wojdyło M. Zastosowanie PCR w diagnostyce chłoniaków skóry z komórek T. Przegl Dermatol 1997; 84: 409-17.
4. Ralfkiaer E, O’Connor NTJ, Crick J, et al. Genotypic analysis of cutaneous T-cell lymphomas. J Invest Dermatol 1987; 88: 762-5.
5. Bakels V, van Oostveen JW, Gordijn RL, et al. Diagnostic value of T-cell receptor beta gene rearrangement analysis on peripheral blood lymphocytes of patients with erytroderma. J Invest Dermatol 1991; 97: 782-6.
6. Bachelez H, Bioul L, Flageul B, et al. Detection of clonal T-cell receptor gamma gene rearrangements with the use of the polymerase chain reaction in cutaneous lesions of mycosis fungoides and Sezary syndrome. Arch Dermatol 1995; 131: 1027-31.
7. Limon J, Nedoszytko B, Brozek I, et al. Chromosome aberrations, spontaneous SCE, and growth kinetics in PHA-stimulated Lymphocytes of five cases with Sezary syndrome. Cancer Genet Cytogenet 1995; 83: 75-81.
8. Siegel RS, Pandolfino T, Guitart J, et al. Primary cutaneous T-cell lymphoma: review and current concepts. J Clin Oncol 2000; 18: 2908-25.
9. Bottaro M, Berti E, Biondi A, et al. Heteroduplex analysis of T-cell receptor gamma gene rearrangements for diagnosis and monitoring of cutaneous T-cell lymphomas. Blood 1994; 83: 3271-8.
10. Theodorou I, Delfau-Larue MH, Bigorgne C, et al. Cutaneous T-cell infiltrates: analysis of T-cell receptor gamma gene rearrangement by polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electrophoresis. Blood 1995; 86: 305-10.
11. Muche JM, Lukowsky A, Asadullah K, et al. Demonstration of frequent occurrence of clonal T cells in the peripheral blood of patients with primary cutaneous T-cell lymphoma. Blood 1997; 90: 1636-42.
12. Fraser-Andrews EA, Woolford AJ, Russell-Jones R, et al. Detection of a peripheral blood T cell clone is an independent prognostic marker in mycosis fungoides. J Invest Dermatol 2000; 114: 117-21.
13. Delfau-Larue MH, Dalac S, Lepage E, et al. Prognostic significance of a polymerase chain reaction-detectable dominant T-lymphocyte clone in cutaneous lesions of patients with mycosis fungoides. Blood 1998; 92: 3376-80.
14. Ponti R, Quaglino P, Novelli M, et al. T-cell receptor gamma gene rearrangement by multiplex polymerase chain reaction/ heteroduplex analysis in patients with cutaneous T-cell lymphoma (mycosis fungoides/Sezary syndrome) and benign inflammatory disease: correlation with clinical, histological and immunophenotypical findings. Br J Dermatol 2005; 153: 565-73.
15. Posnett DN, Sinha R, Kabak S, Russo C. Clonal populations of T cells in normal elderly humans: the T cell equivalent to “benign monoclonal gammapathy”. J Exp Med 1994; 179: 609-18.
16. Vega F, Luthra R, Medeiros LJ, et al. Clonal heterogeneity in mycosis fungoides and its relationship to clinical course. Blood 2002; 100: 3369-73.
17. Kolowos W, Herrmann M, Ponner BB, et al. Detection of restricted junctional diversity of peripheral T cells in SLE patients by spectratyping. Lupus 1997; 6: 701-7.
18. Muche JM, Lukowsky A, Heim J, et al. Demonstration of frequent occurrence of clonal T cells in the peripheral blood but not in the skin of patients with small plaque parapsoriasis. Blood 1999; 94: 1409-17.
19. Wack A, Cossarizza A, Heltai S, et al. Age-related modifications of the human alphabeta T cell repertoire due to different clonal expansions in the CD4+ and CD8+ subsets. Int Immunol 1998; 10: 1281-8.
20. Thangavelu M, Finn WG, Yelavarthi KK, et al. Recurring structural chromosome abnormalities in peripheral blood lymphocytes of patients with mycosis fungoides/Sezary syndrome. Blood 1997; 89: 3371-7.
21. Karenko L, Hahtola S, Paivinen S, et al. Primary cutaneous T-cell lymphomas show a deletion or translocation affecting NAV3, the human UNC-53 homologue. Cancer Res 2005; 65: 8101-10.
22. Mao X, Lillington D, Scarisbrick JJ, et al. Molecular cytogenetic analysis of cutaneous T-cell lymphomas: identification of common genetic alterations in Sezary syndrome and mycosis fungoides. Br J Dermatol 2002; 147: 464-75.
23. Wain EM, Mitchell TJ, Russell-Jones R, Whittaker SJ. Fine mapping of chromosome 10q deletions in mycosis fungoides and Sezary syndrome: identification of two discrete regions of deletion at 10q23.33-24.1 and 10q24.33-25.1. Genes Chromosomes Cancer 2005; 42: 184-92.
24. Fischer TC, Gellrich S, Muche JM, et al. Genomic aberrations and survival in cutaneous T cell lymphomas. J Invest Dermatol 2004; 122: 579-86.
25. Mitelman F, Johansson B, Mertens F (eds). Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer (2006). http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman.
26. Karenko L, Sarna S, Kahkonen M, Ranki A. Chromosomal abnormalities in relation to clinical disease in patients with cutaneous T-cell lymphoma: a 5-year follow-up study. Br J Dermatol 2003; 148: 55-64.
27. Duval A, Raphael M, Brennetot C, et al. The mutator pathway is a feature of immunodeficiency-related lymphomas. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 5002-7.
28. Johnson KL, Tucker JD, Nath J. Frequency, distribution and clonality of chromosome damage in human lymphocytes by multi-color FISH. Mutagenesis 1998; 13: 217-27.
29. Karenko L, Hyytinen E, Sarna S, et al. Chromosomal abnormalities in cutaneous T-cell lymphoma and in its premalignant conditions as detected by G-banding and interphase cytogenetic methods. J Invest Dermatol 1997; 108: 22-9.
30. Broberg K, Toksvig-Larsen S, Lindstrand A, Mertens F. Trisomy 7 accumulates with age in solid tumors and non-neoplastic synovia. Genes Chromosomes Cancer 2001; 30: 310-5.
31. Rubes J, Vozdova M, Robbins WA, et al. Stable variants of sperm aneuploidy among healthy men show associations between germinal and somatic aneuploidy. Am J Hum Genet 2002; 70: 1507-19.
32. Bagot M, Echchakir H, Mami-Chouaib F, et al. Isolation of tumor-specific cytotoxic CD4+ and CD4+CD8dim+ T-cell clones infiltrating a cutaneous T-cell lymphoma. Blood 1998; 91: 4331-41.
33. DeCoteau JF, Butmarc JR, Kinney MC, Kadin ME. The t(2;5) chromosomal translocation is not a common feature of primary cutaneous CD30+ lymphoproliferative disorders: comparison with anaplastic large-cell lymhpoma of nodal origin. Blood 1996; 87: 3437-41.
34. Wong KF, Zhang YM, Chan JKC. Cytogenetic abnormalities in natural killer cell lymphoma/leukaemia – is there a consistent pattern? Leuk Lymphoma 1999; 34: 241-50.